toxreviewТоксикологический вестникToxicological Review0869-79223034-4611Federal Scientific Center of Hygiene named after F.F. Erisman10.36946/0869-7922-2021-29-5-43-48toxreview-532Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESКонструирование иммуноферментной моноклональной тест-системы для выявления шигаподобных токсинов I и II типовDevelopment of enzyme immunoassay for detecting I and II types of shiga-like toxinshttps://orcid.org/0000-0002-5429-6295КуклинаГалина ВикторовнаKuklinaGalina Viktorovna

Кандидат биологических наук, младший научный сотрудник научно-исследовательскогоотдела Филиала ФГБУ 48 ЦНИИ Минобороны РФ, 610000, г. Киров, Россия

noemail@neicon.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8277-3573ПеченкинДенис ВалериевичPechenkinDenis Valerievich

Кандидат медицинских наук, начальник научно-исследовательского отдела Филиала ФГБУ 48 ЦНИИ Минобороны РФ, 610000, г. Киров, Россия.

e-mail: 23527@mil.ru

Ph.D. in Medicine, Head of Research Department Affiliated Branch of the Federal State Budgetary Institution «48th Central Research Institute» of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Kirov, 610000, Russian Federation, 610000, Kirov, Russia.

e-mail: 23527@mil.ru

noemail@neicon.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2881-4730ИпатовСергей СергеевичIpatovSergei Sergeevich

Младший научный сотрудник научно-исследовательского отдела Филиала ФГБУ 48 ЦНИИ Минобороны РФ, 610000, г. Киров, Россия.

noemail@neicon.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3133-1921ЕремкинАндрей ВалентиновичEremkinAndrei Valentinovich

Кандидат биологических наук, начальник группы – заместитель начальника научно-исследовательского отдела Филиала ФГБУ 48 ЦНИИ Минобороны РФ, 610000, г. Киров, Россия.

noemail@neicon.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0277-2226КытмановАлексей АлександровичKytmanovAleksei Aleksandrovich

Кандидат биологических наук, научный сотрудник научно-исследовательского отдела Филиала ФГБУ 48 ЦНИИ Минобороны РФ, 610000, г. Киров, Россия.

noemail@neicon.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8368-9648ТихвинскаяОксана ВикторовнаTikhvinskayaOksana Victorovna

Кандидат биологических наук, младший научный сотрудник научно-исследовательского отдела Филиала ФГБУ 48 ЦНИИ Минобороны РФ, 610000, г. Киров, Россия.

noemail@neicon.ruФилиал ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской ФедерацииРоссияAffiliated Branch of the Federal State Budgetary Institution «48th Central Research Institute» of the Ministry of Defense of the Russian FederationRussian Federation2021141020212954348Copyright © Куклина Г.В., Печенкин Д.В., Ипатов С.С., Еремкин А.В., Кытманов А.А., Тихвинская О.В., 20212021Куклина Г.В., Печенкин Д.В., Ипатов С.С., Еремкин А.В., Кытманов А.А., Тихвинская О.В.Kuklina G.V., Pechenkin D.V., Ipatov S.S., Eremkin A.V., Kytmanov A.A., Tikhvinskaya O.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.toxreview.ru/jour/article/view/532Введение

Введение. Целью работы являлось конструирование иммуноферментной моноклональной тест-системы для выявления шигаподобных токсинов I и II типов и оценка ее диагностических свойств. 

Материал и методы

Материал и методы. В работе использованы гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к шигаподобным токсинам I и II типов, полученные в филиале ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (г. Киров); мыши линии BALB/c; шигаподобные токсины I и II типов. Клетки гибридом культивировали в культуральных флаконах и в перитонеальной полости мышей линии BALB/с. Моноклональные антитела выделяли из асцитических жидкостей путем осаждения насыщенным раствором сульфата аммония с последующей очисткой ионообменной хроматографией. Полученные препараты моноклональных антител использовали для конструирования иммуноферментных тест-систем для выявления шигаподобных токсинов I и II типов. Специфические компоненты иммуноферментных тест-систем подвергали сублимационному высушиванию в защитной среде. 

Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение. В результате проведённых исследований осуществлена наработка и очистка препаративных количеств моноклональных антител к шигаподобным токсинам I и II типов; проведен выбор моноклональных антител для сорбции на твёрдой фазе и для синтеза иммунопероксидазных конъюгатов. 

Заключение

Заключение. сконструирована экспериментальная иммуноферментная тест-система, позволяющая в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа выявлять шигаподобные токсины I и II типов в концентрации 1 нг/мл и более.

Introduction

Introduction. The aim of the work was development of enzyme immunoassay for detecting I and II types of shiga-like toxins and assessment of it diagnostic properties. 

Materials and methods

Materials and methods. For the research, we used hybridomas producing monoclonal antibodies to shiga-like toxins of types I and II, obtained at the branch of the Federal State Budgetary Institution “48 Central Research Institute” of the Ministry of Defense of Russian Federation (Kirov); BALB/c mice; shiga-like toxins of types I and II. Hybridoma cells were cultured in culture flasks and in the peritoneal cavity of BALB/c mice. Monoclonal antibodies were isolated from ascitic fluids by precipitation with a saturated solution of ammonium sulfate, followed by purification by ion exchange chromatography. The obtained preparations of monoclonal antibodies were used to develop enzyme immunoassay for the detection of shiga-like toxins of types I and II. Specific components of enzyme immunoassay were freeze-dried in a protective environment.

Results

Results. As a result of research, preparative quantities of monoclonal antibodies against I and II types of shiga-like toxins were obtained and purified; selection of monoclonal antibodies for sorption on the solid phase and for the synthesis of immunoperoxidase conjugates was carried out. 

Conclusion

Conclusion. Experimental enzyme immunoassay allowing to identify 1 ng/ml I and II types of shiga-like toxins in «sandwich»-ELISA was developed.

шигаподобные токсинымоноклональные антителатест-системаиммуноферментный анализshiga-like toxinsmonoclonal antibodiesenzyme immunoassayELISAReferencesМelton-Celsa A.R. Shiga toxin (Stx). Classification, structure, and Function. Microbiol Spectr. 2014; 2(2): 23. https://doi.org/10.1128/9781555818791.ch3Мelton-Celsa A.R. Shiga toxin (Stx). Classification, structure, and Function. Microbiol Spectr. 2014; 2(2): 23. https://doi.org/10.1128/9781555818791.ch3Joseph A., Cointe A., Mariani Kurkdjian P. Shiga Toxin-Associated hemolytic uremic syndrome: А narrative review. Toxins (Basel). 2020; 12: 67. https://doi.org/10.3390/toxins12020067Joseph A., Cointe A., Mariani Kurkdjian P. Shiga Toxin-Associated hemolytic uremic syndrome: А narrative review. Toxins (Basel). 2020; 12: 67. https://doi.org/10.3390/toxins12020067E. coli: Rapid Responce in a crisis. European Food Safety Authority. Available at: https://www.efsa.europa.eu/en/press/news/120711.E. coli: Rapid Responce in a crisis. European Food Safety Authority. Available at: https://www.efsa.europa.eu/en/press/news/120711.Онищенко Г.Г., Дятлов И.А., Светоч Н.В. Молекулярно-генетическая характеристика шига-токсинпродуцирующих Escherichia сoli, выделенных при вспышке пищевой инфекции в Санкт-Петербурге в 2013 году. Вестник РАМН. 2015; 1: 70-80Onishenko G., Dyatlov I., Svetoch N. Molecular genetic characteristics of shiga-toxins released during a food outbreak in St.Petersburg in 2013. Vestnik RAMN. 2015; 1: 70-80. (in Russian)Gyles C.L. Shiga toxin-producing Escherichia coli: An overview. J. Anim. Sci. 2007; 85: 45-62.Gyles C.L. Shiga toxin-producing Escherichia coli: An overview. J. Anim. Sci. 2007; 85: 45-62.Paletta A.C., Castro V.S., Conte-Junior C.A. Shiga toxin-producing and enteroaggregative Echerichia coli in animal, foods and humans: pathogenicity, mechanisms, detection methods, and epidemiology. Curr. Microbiol. 2019: 1-9. https://doi.org/10.1007/s00284-019-01842-1Paletta A.C., Castro V.S., Conte-Junior C.A. Shiga toxin-producing and enteroaggregative Echerichia coli in animal, foods and humans: pathogenicity, mechanisms, detection methods, and epidemiology. Curr. Microbiol. 2019: 1-9. https://doi.org/10.1007/s00284-019-01842-1.Taylor М.С. Enterohaemorrhagic Escherichia coli and Shigella dysenteriae type 1-induced haemolytic uraemic syndrome. Pediatr. Nephrol. 2008; 23: 1425-31.Taylor М.С. Enterohaemorrhagic Escherichia coli and Shigella dysenteriae type 1-induced haemolytic uraemic syndrome. Pediatr. Nephrol. 2008; 23: 1425-31.МУК 4.2.2963-11. Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Escherichia coli, продуцирующих шига-токсины (STEC-культуры) и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах. Москва, 2011. https://www.docs.cntd.ru/document/1200094087Guidelines 4.2.2963-11 for laboratory diagnosis of diseases caused by Escherichia coli producing shiga toxins (STEC-cultures) and the detection of pathogens STEC-infections in food products. Moscow, 2011. Available at: https://www.docs.cntd.ru/document/1200094087. (in Russian)Laemmli U.K. Сleavage of structural proteins durimg the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227 (5259): 680-85.Laemmli U.K. Сleavage of structural proteins durimg the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227 (5259): 680-85.Szewczak A.A., Moore P.B., Chan Y.L. The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 90: 9581-85.Szewczak A.A., Moore P.B., Chan Y.L. The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 90: 9581-85.Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193(1): 265-75.Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193(1): 265-75.Д. Кэтти, ред. Антитела. Методы. Кн. 1. М.: Мир, 1991D. Kettyu, ed. Antibodies. Methods. Vol. 1 [Antitela. Metody. Kn. 1]. Translated from English. Moscow: Mirbeau; 1991. (in Russian)Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12): 1084-91Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugated. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12): 1084-91.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.