toxreviewТоксикологический вестникToxicological Review0869-79223034-4611Federal Scientific Center of Hygiene named after F.F. Erisman10.47470/0869-7922-2022-30-6-377-385toxreview-654Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESДоклинические исследования острой токсичности CAR-клеточных продуктов для терапии злокачественных новообразований на примере «анти-HER2-CAR-T/CAR-NK»Preclinical acute toxicity studies of the CAR technology products for malignant neoplasms therapy on the example of the «anti-HER2-CAR-T/CAR-NK»https://orcid.org/0000-0003-4004-5214ГорячеваНаталья АлександровнаGoryachevaNatal’ya Aleksandrovna

Младший научный сотрудник лаборатории биологических испытаний ФИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, аспирант ФГБОУ ВО Пущинского государственного естественно-научного института, 142290, г. Пущино, Московская область, Российская Федерация.

e-mail: natasha.goryacheva2017@yandex.ru

Junior researcher of Biological Testing Laboratory, Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry Russian Academy of Sciences, PhD student of Pushchino State Institute of Natural Sciences, Pushchino, Russian Federation.

e-mail: natasha.goryacheva2017@yandex.ru

natasha.goryacheva2017@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0520-4021РжевскийДмитрий ИвановичRzhevskiyDmitrij Ivanovic

Кандидат биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории биологических испытаний ФИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, 142290, Пущино, Российская Федерация.

e-mail: rjevski@bibch.ru 

rjevski@bibch.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4422-487XСлащеваГульсара АмангалиевнаSlashhevaGulsara Amsngalievna

Кандидат биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории биологических испытаний, ФИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, 142290, Пущино, Российская Федерация.

e-mail: slashcheva_ga@mail.ru 

slashcheva_ga@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9145-2736НовиковаНадежда ИвановнаNovikovaNadezhda Ivanovna

Кандидат биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории биологических испытаний, ФИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, 142290, Пущино, Российская Федерация.

e-mail: novikova@bibsh.ru 

novikova@bibsh.ruhttps://orcid.org/0000-0002-0132-167XКиселевскийМихаил ВалентиновичKisilevskiyMikhail Valentinivich

Доктор мед. наук, профессор, руководитель лаборатории клеточного иммунитета ФГБНУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Минздрава России, 115478, Москва, Российская Федерация.

e-mail: kisele@inbox.ru 

kisele@inbox.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0769-1695ЧикилеваИрина ОлеговнаChikilevaIrina Olegovna

Кандидат биол. наук, младший научный сотрудник лаборатории клеточного иммунитета ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Минздрава России, 115478, Москва, Российская Федерация.

e-mail: irinatchikileva@mail.ru 

irinatchikileva@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3560-001XВласенкоРаймонда ЯновнаVlasenkoRajmonda Yanovna

Кандидат биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточного иммунитета ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Российская Федерация.

e-mail: vlasenko2002@bk.ru 

vlasenko2002@bk.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3053-2804ДьяченкоИгорь АлександровичDyachenkoIgor Aleksandrovich

Кандидат биол. наук, заведующий лабораторией, старший научный сотрудник лаборатории биологических испытаний, ФИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, доцент ФГБОУ ВОПущинского государственного естественно-научного института, 142290, Пущино, Российская Федерация.

e-mail: dyachenko@bibch.ru 

dyachenko@bibch.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2279-9285МурашевАркадий НиколаевичMurashevArkadij Nikolaevich

Доктор биол. наук, профессор., руководитель, ведущий научный сотрудник лаборатории биологических испытаний ФИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, декан БиоМедФармТехнологического факультета ФГБОУ ВО Пущинского государственного естественно-научного института, 142290, Пущино, Российская Федерация.

e-mail: murashev@bibch.ru 

murashev@bibch.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8055-0066БондаренкоДмитрий АлександровичBondarenkoDmitrij Aleksandrovich

Кандидат биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории биологических испытаний ФИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, 142290, Пущино, Российская Федерация.

e-mail: bondarenko@bibch.ru 

bondarenko@bibch.ruФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук; ФГБОУ ВО «Пущинский государственный естественно-научный институт»РоссияBranch of the Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry Russian Academy of Sciences; Pushchino State Institute of Natural SciencesRussian FederationФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наукРоссияBranch of the Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry Russian Academy of SciencesRussian FederationФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияN.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Healthcare of the Russian FederationRussian Federation202227122022306377385Copyright © Горячева Н.А., Ржевский Д.И., Слащева Г.А., Новикова Н.И., Киселевский М.В., Чикилева И.О., Власенко Р.Я., Дьяченко И.А., Мурашев А.Н., Бондаренко Д.А., 20222022Горячева Н.А., Ржевский Д.И., Слащева Г.А., Новикова Н.И., Киселевский М.В., Чикилева И.О., Власенко Р.Я., Дьяченко И.А., Мурашев А.Н., Бондаренко Д.А.Goryacheva N.A., Rzhevskiy D.I., Slashheva G.A., Novikova N.I., Kisilevskiy M.V., Chikileva I.O., Vlasenko R.Y., Dyachenko I.A., Murashev A.N., Bondarenko D.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.toxreview.ru/jour/article/view/654Введение

Введение. Car-T-клеточная терапия является современным перспективным методом в лечении онкологических заболеваний. На сегодняшний день управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США одобрено шесть препаратов для клеточной иммунотерапии онкологических заболеваний крови. Однако отсутствует информация о доклинических испытаниях данных биомедицинских клеточных продуктов, так как используемые в них Т-клетки, несущие химерный антигенный рецептор, являются аутологичными для человека, что представляет проблему для применения к ним классических токсикологических тестов. Кроме того, это ставит под сомнение безопасность данных лекарственных средств, поэтому разрабатываются различные стратегии доклинических исследований, которые позволили бы преодолеть вышеуказанные проблемы и создать адекватные тест-системы с терапевтической мишенью.

Цель исследования — оценка острой токсичности противоопухолевого препарата на основе генетически модифицированных T/NK-клеток, экспрессирующих химерный Т-клеточный рецептор против антигена HER2, на иммунодефицитных мышах линии BALB/c Nude.

Материал и методы

Материал и методы. Опытная и контрольная группы включали 5 самцов и 5 самок. Тестируемый препарат, а также носитель (растворитель-криоконсервант) животным вводили однократно внутривенно или внутрибрюшинно, в объеме 0,2 мл/животное. Опытным животным исследуемый препарат вводили в двух дозах: 0,5 • 106 клеток/животное, эквипотенциальной терапевтической дозе для человека, и 5 • 106 клеток/животное, в 10 раз превышающей терапевтическую дозу. В ходе исследования у животных регистрировали вес тела, потребление корма и проявление клинических признаков токсичности исследуемого препарата. На 15-й день исследования животные были подвергнуты эвтаназии и некропсии с осмотром макроповреждений органов, их взвешиванием и фиксацией. С целью выявления токсического действия тестируемого биомедицинского клеточного продукта проводили гистологический анализ.

Результаты

Результаты. Установлено, что однократное внутривенное или внутрибрюшинное введение биомедицинского продукта «анти-HER2-CAR-T/CAR-NK» в дозе, эквивалентной терапевтической для человека, а также в 10 раз превышающей терапевтическую, является безопасным для мышей BALB/c Nude. Проведённое доклиническое исследование продемонстрировало отсутствие значимых токсических эффектов. 

Ограничения исследования

Ограничения исследования. Исследование выполнено на иммунодефицитных мышах линии BALB/c Nude, поскольку исследуемый продукт содержал живые чужеродные клетки.

Заключение

Заключение. Данная работа может стать основой для создания протокола по доклиническим испытаниям биомедицинских клеточных продуктов, полученных с помощью CAR- технологий.

Соблюдение этических стандартов. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с Протоколом-заявкой на животных, рассмотренным и одобренным «Институтской комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных» ФИБХ РАН.

Участие авторов

Участие авторов: Горячева Н.А., Бондаренко Д.А., Ржевский Д.И., Слащева Г.А., Новикова Н.И., Дьяченко И.А., Мурашев А.Н. — сбор и обработка материала, сбор данных литературы, написание текста; Ржевский Д.И. — обработка материала и статистический анализ; Киселевский М.В., Чикилева И.О., Власенко Р.Я. — концепция и дизайн исследования. Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

Конфликт интересов

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Поступила в редакцию

Поступила в редакцию: 08 февраля 2022 / Принята в печать: 12 декабря 2022 / Опубликована: 30 декабря 2022

Introduction

Introduction. The Car-T-cell therapy is current and modern promising method for the oncology treatment. USA Food and Drug Sanitary Control Department confirms six drugs for cellular immunotherapy the blood oncology today. But the information about biomedical product preclinical test is absent, because used T-cells (cell with chimeric antigen receptor) are autologous for humans, which is the problem for use classic toxicity tests. Besides the biomedical product safety becomes questionable, therefore the different preclinical research strategy is developed to solve those problems and produce normal test-systems with therapeutic target.

The aim of the study was to evaluate the acute toxicity in immunodeficient BALB/c Nude mice of an antineoplastic drug based on genetically modified T/NK cells that express a chimeric T-cell anti-HER2 receptor.

Material and methods

Material and methods. Test and control groups consisted of five males and five females. Animals were injected a single intravenous or intraperitoneal injection of the testing product and the solvent-cryopreserving carrier at the dose 0,2 ml/animal. There were two doses: equal to the human therapeutic 0,5•106 cell/animal dose and ten times over then the therapeutic dose 5•106 cell/animal. During the test the animal’s weight, the food intake and clinically symptoms of the testing product toxicity were registered. On the fifteenth of the study day animals were euthanatized and exposed to a necropsy with the organs’ macroscopic inspection, the weighting and fixating. The detection of the testing biomedical product toxicity was the aim of the histology analysis.

Results

Results. A single intravenous or intraperitoneal injection of the biomedical product «anti-HER2-CAR-T/ CAR-NK» at the human therapeutic dose, as well as in 10 times more than the same, is safe for BALB/c Nude mice. The preclinical study has shown the absence of significant toxic effects.

Limitations

Limitations. The research was performed on Balb/c nude line immunodeficient mice, because the tested product contained living foreign cells.

Conclusion

Conclusion. This work can be the main basis for the creation of biomedical product preclinical research protocol of biomedical cell products produced from CAR-technology.

Compliance with ethical standards. All manipulations with animals were carried out in accordance with the Animal Application Protocol, which was examined and approved of IACUC of the Branch of the IBCh RAS.

Author contribution

Author contribution: Goryacheva N.А., Bondarenko D.А., Rzhevskiy D.I., Slashheva G.A., Novikova N.I., Dyachenko I.A., Murashev A.N. — сollection and processing of material, literature review, writing the text; Rzhevskiy D.I. — сollection and processing of material, statistical analysis; Kisilevskiy M.V., Chikileva I.O., Vlasenko R.Ya. — the concept and design of the study. All authors are responsible for the integrity of all parts of the manuscript and approval of the manuscript final version.

Conflict of interests

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.

Funding

Funding. The study had no sponsorship.

Received

Received: February 08, 2022 / Accepted: December 12, 2022 / Published: December 30, 2022

химерный рецептор антигенаCARCAR-TCAR-NKиммунологияисследования токсичностиchimeric antigen receptorCARCAR-TCAR-NKimmunologytoxicity studiesReferencesDaher M., Rezvani K. Outlook for new CAR-based therapies with a focus on CAR-NK cells: what lies beyond CAR-engineered T cells in the race against cancer. Cancer Discov. 2021 Jan; 11(1): 45-58. https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-20-0556Daher M., Rezvani K. Outlook for new CAR-based therapies with a focus on CAR-NK cells: what lies beyond CAR-engineered T cells in the race against cancer. Cancer Discov. 2021 Jan; 11(1): 45–58. https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-20-0556Morgan M.A, Büning H., Sauer M., Schambach A. Use of Cell and Genome Modification Technologies to Generate Improved “Off-the-Shelf” CAR T and CAR NK Cells. Front Immunol. 2020 Aug 7; 11: 1965. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01965Morgan M.A, Büning H., Sauer M., Schambach A. Use of Cell and Genome Modification Technologies to Generate Improved “Off-the-Shelf” CAR T and CAR NK Cells. Front Immunol. 2020 Aug 7; 11: 1965. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01965Киселевский М.В., Чикилева И.О., Ситдикова С.М., Власенко Р.Я., Караулов А.В. Перспективы применения генетически модифицированных лимфоцитов с химерным Т-клеточным рецептором (CAR-T-клеток) для терапии солидных опухолей. Иммунология. 2019; 40(4): 48-55. https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-14006Kiselevsky M.V., Chikileva I.O., Sitdikova S.M., Vlasenko R.Ya., Karaulov A.V. Prospectives for application of the genetically modified lymphocytes with chimeric T-cell receptor (CAR-T-cells) for the therapy of solid tumors. Immunologiya. 2019; 40(4): 48–55. https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-14006 (in Russian)Majzner R.G., Mackall C.L. Clinical lessons learned from the first leg of the CAR T cell journey. Nat Med. 2019; 25: 1341-55. https://doi.org/10.1038/s41591-019-0564-6Majzner R.G., Mackall C.L. Clinical lessons learned from the first leg of the CAR T cell journey. Nat Med. 2019; 25: 1341–55. https://doi.org/10.1038/s41591-019-0564-6Tahmasebi S., Elahi R., Khosh E. et al. Programmable and multi-targeted CARs: a new breakthrough in cancer CAR-T cell therapy. Clin Transl Oncol. 2021; 23: 1003-19. https://doi.org/10.1007/s12094-020-02490-9Tahmasebi S., Elahi R., Khosh E. et al. Programmable and multi-targeted CARs: a new breakthrough in cancer CAR-T cell therapy. Clin Transl Oncol. 2021; 23: 1003–19. https://doi.org/10.1007/s12094-020-02490-9Xie G., Dong H., Liang Y., Ham J.D., Rizwan R., Chen J. CAR-NK cells: A promising cellular immunotherapy for cancer. EBioMedicine. 2020; 59: 102975. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2020.102975Xie G., Dong H., Liang Y., Ham J.D., Rizwan R., Chen J. CAR-NK cells: A promising cellular immunotherapy for cancer. EBioMedicine. 2020; 59: 102975. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2020.102975Gong Y., Klein Wolterink R., Wang J., Bos G., Germeraad W. J Hematol Clinical lessons learned from the first leg of the CAR T cell journey. Oncol. 2021; 14(1): 73.Gong Y., Klein Wolterink R., Wang J., Bos G., Germeraad W. J Hematol Clinical lessons learned from the first leg of the CAR T cell journey. Oncol. 2021; 14(1): 73.Maoz M., Devir M., Inbar M., Inbar-Daniel Z., Sherill-Rofe D., Bloch I., Meir K., Edelman D., Azzam S., Nechushtan H., Maimon O., Uziely B., Kadouri L., Sonnenblick A., Eden A., Peretz T., Zick A. Clinical implications of sub-grouping HER2 positive tumors by amplicon structure and co-amplified genes. Sci Rep. 2019; 9(1): 18795. https://doi.org/10.1038/s41598-019-55455-6Maoz M., Devir M., Inbar M., Inbar-Daniel Z., Sherill-Rofe D., Bloch I., Meir K., Edelman D., Azzam S., Nechushtan H., Maimon O., Uziely B., Kadouri L., Sonnenblick A., Eden A., Peretz T., Zick A. Clinical implications of sub-grouping HER2 positive tumors by amplicon structure and co-amplified genes. Sci Rep. 2019; 9(1): 18795. https://doi.org/10.1038/s41598-019-55455-6KYMRIAH (tisagenlecleucel). 28 марта 2019 г. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/kymriah-tisagenlecleucelKYMRIAH (tisagenlecleucel). 28 марта 2019 г. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/kymriah-tisagenlecleucelYESCARTA (axicabtagene ciloleucel). 28 мая 2019 г. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/yescarta-axicabtagene-ciloleucelYESCARTA (axicabtagene ciloleucel). 28 мая 2019 г. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/yescarta-axicabtagene-ciloleucelTECARTUS (brexucabtagene autoleucel). 17 декабря 2021 г. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/tecartus-brexucabtagene-autoleucelTECARTUS (brexucabtagene autoleucel). 17 декабря 2021 г. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/tecartus-brexucabtagene-autoleucelCARVYKTI. 8 марта 2022 г. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/carvyktiCARVYKTI. 8 марта 2022 г. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/carvyktiBREYANZI (lisocabtagene maraleucel). 4 марта 2021 г. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/breyanzi-lisocabtagene-maraleucelBREYANZI (lisocabtagene maraleucel). 4 марта 2021 г. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/breyanzi-lisocabtagene-maraleucelABECMA (idecabtagene vicleucel). 21 апреля 2021. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/abecma-idecabtagene-vicleucelABECMA (idecabtagene vicleucel). 21 апреля 2021. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/abecma-idecabtagene-vicleucelPing-Pin Zheng, Johan M. Kros, Jin Li Approved CAR T cell therapies: ice bucket challenges on glaring safety risks and long-term impacts. Drug Discovery Today. 2018; 23(6): 1175-82. Epub 2018 Mar 1. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2018.02.012Ping-PinZheng, Johan M. Kros, Jin Li Approved CAR T cell therapies: ice bucket challenges on glaring safety risks and long-term impacts. Drug Discovery Today. 2018; 23(6): 1175-82. Epub 2018 Mar 1. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2018.02.012ГОСТ Р 57147-2016. Лекарственные средства для медицинского применения. Доклинические исследования противоопухолевых лекарственных средств. М.: Стандартинформ, 2016.GOST R 57147-2016. Medicinal products for medical use. Preclinical studies of antitumor drugs. Moscow: Standartinform, 2016. (in Russian)Доклинические исследования противоопухолевых лекарственных средств. 21 ноября 2016 г. Доступно: https://search.rsl.ru/ru/record/01008689962Medicine for medical application. Nonclinical evaluation for anticancer pharmaceuticals. 2017. Available at: https://search.rsl.ru/ru/record/01008689962 (in Russian)Бунатян Н.Д. Васильев А.Н. и др. Руководствo по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 2. М.: Гриф и К, 2012.Bunyatyan N.D. Vasiliev A.N. et al. Guidelines for conducting preclinical studies of drugs. Part 2.Moscow: Grif and K, 2012. https://search.rsl.ru/ru/record/01008689962 (in Russian)Ефименко А.Ф., Калинина Н.И., Макаревич П.И. Методические рекомендации по проведению доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов, М.: 2017.Efimenko A.F., Kalinina N.I., Makarevich P.I. Methodical recommendations for conducting preclinical studies of biomedical cell products. Moscow: Lomonosov Moscow State University, 2017. ISBN: 978-5-8493-0352-9 (in Russian)Washington D.C. The Guide for Care and Use of Laboratory Animals - National Academy Press, 2011. 247 р. Available at: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdfWashington D.C. The Guide for Care and Use of Laboratory Animals - National Academy Press, 2011. 247 р. Available at: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdfDasyam N., George P., Weinkove R. Chimeric antigen receptor T-cell therapies: Optimising the dose. Clin Pharmacol. 2020 Sep; 86(9): 1678-89. https://doi.org/10.1111/bcp.14281Dasyam N., George P., Weinkove R. Chimeric antigen receptor T-cell therapies: Optimising the dose. Clin Pharmacol. 2020 Sep; 86(9): 1678–89. https://doi.org/10.1111/bcp.14281Gong, Y., Klein Wolterink R.G.J., Wang, J. et al. Chimeric antigen receptor natural killer (CAR-NK) cell design and engineering for cancer therapy. Hematol Oncol. 2021; 14(73): 1-35. https://doi.org/10.1186/s13045-021-01083-5Gong, Y., Klein Wolterink R.G.J., Wang, J. et al. Chimeric antigen receptor natural killer (CAR-NK) cell design and engineering for cancer therapy. Hematol Oncol. 2021; 14(73): 1-35. https://doi.org/10.1186/s13045-021-01083-5Guidance for Industry M3(R2) Nonclinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals January 2010 Revision 1 ICH. Jule 2008. Available at: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-m-3-r2-non-clinical-safety-studies-conduct-human-clinical-trials-marketing-authorization_en.pdfGuidance for Industry M3(R2) Nonclinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals January 2010 Revision 1 ICH. Jule 2008. Available at: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-m-3-r2-non-clinical-safety-studies-conduct-human-clinical-trials-marketing-authorization_en.pdf

The authors declare that there are no conflicts of interest present.