toxreviewТоксикологический вестникToxicological Review0869-79223034-4611Federal Scientific Center of Hygiene named after F.F. Erisman10.47470/0869-7922-2023-31-2-120-126toxreview-692Research ArticleМЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В ТОКСИКОЛОГИИ И АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИRESEARCH METHODS IN TOXICOLOGY AND ANALYTICAL CHEMISTRYРазработка и валидация методики количественного определения ротенона в гомогенате коры головного мозга крыс методом высокоэффективной жидкостной хроматографииDevelopment and validation of a method for the quantitative determination of rotenone in the homogenate of the cerebral cortex of rats by high-performance liquid chromatography (HPLC)https://orcid.org/0000-0002-2246-4127ГрадинарьМария МихайловнаGradinarMaria Mikhailovnamasha.gradinar1995@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1688-0017ЩулькинАлексей ВладимировичShchulkinAlexey Vladimirovichalekseyshulkin@rambler.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5618-7607ЧерныхИван ВладимировичChernykhIvan Vladimirovich

Доктор биол. наук, доцент, заведующий кафедрой фармацевтической химии ФГБОУ ВО «Рязанский ГМУ имени академика И.П. Павлова» МЗ РФ, 390026, г. Рязань.

e-mail: ivchernykh88@mail.ru

Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Pharmaceutical Chemistry, Ryazan State Medical University, Ministry of Health of Russia, 390026, Ryazan, Russian Federation.

e-mail: ivchernykh88@mail.ru

ivchernykh88@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6887-4888ЯкушеваЕлена НиколаевнаYakushevaElena Nikolaevnae.yakusheva@rzgmu.ruФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияRyazan State Medical UniversityRussian Federation202327042023312120126Copyright © Градинарь М.М., Щулькин А.В., Черных И.В., Якушева Е.Н., 20232023Градинарь М.М., Щулькин А.В., Черных И.В., Якушева Е.Н.Gradinar M.M., Shchulkin A.V., Chernykh I.V., Yakusheva E.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.toxreview.ru/jour/article/view/692Введение

Введение. Ротенон — нейротоксин, вызывающий повреждение дофаминергических нейронов чёрной субстанции и используемый в качестве средства для моделирования экспериментального паркинсонического синдрома. Разработка методики количественного определения ротенона в головном мозге позволит предложить и апробировать новые стратегии фармакотерапии паркинсонизма, связанные со снижением проникновения нейротоксических веществ в мозг.

Цель исследования заключалась в разработке и валидации ВЭЖХ-методики (высокоэффективная жидкостная хроматография) количественного определения ротенона в коре больших полушарий головного мозга крыс.

Материал и методы

Материал и методы. Количественное определение ротенона осуществляли с помощью хроматографической системы Stayer («Аквилон», Россия) с УФ-спектрофотометрическим детектором UVV 104 при длине волны 296 нм в изократическом режиме. Применяли обращенно-фазную хроматографическую колонку Luna C18 100Å (250*4,6) с зернением 5 мкм при температуре 37°С. Состав подвижной фазы: вода деионизированная, ацетонитрил в соотношении 70:30. Определение концентрации ротенона проводили методом абсолютной калибровки по площади пиков.

Пробоподготовка заключалась в гомогенизации 500 мг измельченной лобной доли коры головного мозга крыс в 500 мкл воды очищенной с последующим центрифугированием (1750 g), отбором надосадочной жидкости, осаждением белка ацетонитрилом (2,5 мл). Водный слой упаривали на роторно-вакуумном испарителе. К сухому остатку добавляли 250 мкл подвижной фазы и 100 мкл инжектировали в хроматограф.

Результаты

Результаты. Методика была валидирована по следующим параметрам: селективность, линейность, точность, прецизионность, пределы обнаружения и определения, перенос пробы, стабильность образцов. Аналитический диапазон составил 62,5−1000,0 нг/г мозга с коэффициентом корреляции более 0,99. Предел обнаружения и количественного определения ротенона составляли соответственно 25,0 и 62,5 нг/г. Расчет внутри- и межцикловой точности и прецизионности показал, что данные параметры не превышают 20% для концентрации, соответствующей нижнему пределу количественного определения, и 15% — для более высоких концентраций. Стабильность методики продемонстрирована при краткосрочном хранении в условиях комнатной температуры, трехкратном цикле заморозки-разморозки при минус 80°С, хранении при минус 80°С в течение 60 сут. Перенос пробы отсутствовал.

Ограничения исследования

Ограничения исследования. Разработанная хроматографическая методика позволяет анализировать содержание ротенона в коре головного мозга крыс в диапазоне концентраций 62,5−1000,0 нг/г.

Заключение

Заключение. Разработана и валидирована методика количественного определения ротенона в гомогенате коры больших полушарий головного мозга крыс.

Соблюдение этических стандартов. Экспериментальное исследование было одобрено комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.

Участие авторов

Участие авторов: Градинарь М.М. — выполнение хроматографических исследований, пробоподготовка; Щулькин А.В. — статистическая обработка результатов, написание текста; Черных И.В. — выполнение хроматографических исследо-ваний, расчёт валидационных параметров; Якушева Е.Н. — руководство исследованием, написание текста. Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

Конфликт интересов

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. 

Финансирование

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Поступила в редакцию

Поступила в редакцию: 08 июня 2023 / Принята в печать: 02 февраля 2023 / Опубликована: 30 апреля 2023 

Introduction

Introduction. Rotenone is a neurotoxin that causes damage of dopaminergic neurons in the substantia nigra and is used as a model for experimental parkinsonian syndrome. The development of a technique for the quantitative determination of rotenone in the brain will allow testing new strategies for the pharmacotherapy of parkinsonism by reducing the penetration of toxic substances into the brain.

The aim of the study was to develop and validate an HPLC method for the quantitative determination of rotenone in the cerebral cortex of rats.

Material and methods

Material and methods. Quantitative determination of rotenone was carried out using a Stayer chromatographic system (Аквилон, Russia) with a UV spectrophotometric detector UVV 104 at a wavelength of 296 nm in isocratic mode. A reverse-phase chromatographic column Luna C18 100Å (250*4.6) with a grain size of 5 μm at a temperature of 37°C was used. The composition of the mobile phase was deionized water, acetonitrile in a ratio of 70:30. Determination of rotenone concentration was carried out by the method of absolute calibration by the area of the peaks.

Sample preparation consisted in homogenization of 500 mg of crushed frontal lobe of the rat cerebral cortex in 500 μl of purified water, followed by centrifugation (1750 g), collection of the supernatant and sedimentation of the proteins by acetonitrile. The liquid layer was evaporated on a rotary vacuum. 250 µl of the mobile phase was added to the dry residue, and 100 µl was injected into the chromatograph.

Results

Results. The method was validated for the following parameters: selectivity, linearity, accuracy, precision, limits of detection and determination, sample transfer, sample stability. The analytical range was 62.5−1000.0 ng/g brain with a correlation coefficient of more than 0.99. The limits of detection and quantification of rotenone were 25.0 and 62.5 ng/g, respectively. The calculation of intra- and inter-cycle accuracy and precision showed that these parameters do not exceed 20% for the concentration corresponding to the lower limit of quantitative determination, and 15% for higher concentrations. The stability of the technique was demonstrated during short-term storage at room temperature, three freeze-thaw cycles at –80°C, and storage at –80°C for 60 days. There was no sample transfer.

Limitations

Limitations. The chromatographic technique makes it possible to analyze the content of rotenone in the cerebral cortex of rats in the concentration range of 62.5–1000.0 ng/g.

Conclusion

Conclusion. A method for the quantitative determination of rotenone in the homogenate of the cerebral cortex of rats has been developed and validated.

Compliance with ethical standards. The experimental study was approved by the commission for control over the maintenance and use of laboratory animals of the Ryazan State Medical University.

Author contribution

Author contribution: Gradinar M.M. — performance of chromatographic studies, sample preparation; Shchulkin A.V. — statistical processing of the obtained results, writing an article; Chernykh I.V. — performance of chromatographic studies, calculation of validation parameters; Yakusheva E.N. — writing an article, general management of the work. All co-authors — approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article.

Conflict of interests

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interest.

Funding

Funding. The study was not sponsored.

Received

Received: January 1, 2023 / Accepted: February 2,2023 / Published: April 30, 2023

ротенонВЭЖХкора больших полушарий мозгакрысыrotenoneHPLCcerebral cortexratsReferencesSherer T.B., Betarbet R., Testa C.M., Seo B.B., Richardson J.R., Kim J.H., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson’s disease. Journal of Neuroscience. 2003; 23(34): 10756–64. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.23-34-10756.2003Sherer T.B., Betarbet R., Testa C.M., Seo B.B., Richardson J.R., Kim J.H., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson’s disease. Journal of Neuroscience. 2003; 23(34): 10756–64. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.23-34-10756.2003Watabe M., Nakaki T. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone inhibits and redistributes vesicular monoamine transporter 2 via nitration in human dopaminergic SH-SY5Y cells. Molecular Pharmacology. 2008; 74: 933–40. https://doi.org/10.1124/mol.108.048546Watabe M., Nakaki T. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone inhibits and redistributes vesicular monoamine transporter 2 via nitration in human dopaminergic SH-SY5Y cells. Molecular Pharmacology. 2008; 74: 933–40. https://doi.org/10.1124/mol.108.048546Alam M., Schmidt W.J. l-DOPA reverses the hypokinetic behavior and rigidity in rotenone-treated rats. Behavioural Brain Research. 2004; 153: 439–46. https://doi.org/10.1016/j.bbr.2003.12.021Alam M., Schmidt W.J. l-DOPA reverses the hypokinetic behavior and rigidity in rotenone-treated rats. Behavioural Brain Research. 2004; 153: 439–46. https://doi.org/10.1016/j.bbr.2003.12.021Betarbet R., Sherer T.В., Greenamyre J.T. Animal models of Parkinson Disease. Bioessays. 2002; 24(4): 308–18. https://doi.org/10.1002/bies.10067Betarbet R., Sherer T.В., Greenamyre J.T. Animal models of Parkinson Disease. Bioessays. 2002; 24(4): 308–18. https://doi.org/10.1002/bies.10067De Miranda B.R., Fazzari M., Rocha E.M., Castro S., Greenamyre J.T. Sex differences in rotenone sensitivity reflect the male-to-female ratio in human Parkinson’s disease incidence. Toxicol Sci. 2019; 170(1): 133−43. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfz082De Miranda B.R., Fazzari M., Rocha E.M., Castro S., Greenamyre J.T. Sex differences in rotenone sensitivity reflect the male-to-female ratio in human Parkinson’s disease incidence. Toxicol Sci. 2019; 170(1): 133−43. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfz082Caboni P., Sarais G., Vargiu S., Luca M.A., Garau V.L., Ibba A., Cabras P. LC–MS–MS Determination of Rotenone, Deguelin, and Rotenolone in Human Serum. Chromatographia. 2008; 68: 739−45. https://doi.org/10.1365/s10337-008-0830-0Caboni P., Sarais G., Vargiu S., Luca M.A., Garau V.L., Ibba A., Cabras P. LC–MS–MS Determination of Rotenone, Deguelin, and Rotenolone in Human Serum. Chromatographia. 2008; 68: 739−45. https://doi.org/10.1365/s10337-008-0830-0Di Donna L., Grassi G., Mazzotti F., Perri E., Sindona G. High-throughput assay of rotenone in olive oil using atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 2004; 39(12): 1437−40. https://doi.org/10.1002/jms.694Di Donna L., Grassi G., Mazzotti F., Perri E., Sindona G. High-throughput assay of rotenone in olive oil using atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 2004; 39(12): 1437−40. https://doi.org/10.1002/jms.694Taylor M.J., Keenan G.A., Reid K.B., Fernandez D.U. The utility of ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionisation time-of-flight mass spectrometry for multi-residue determination of pesticides in strawberry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2008; 22(17): 2731−46. https://doi.org/10.1002/rcm.3671Taylor M.J., Keenan G.A., Reid K.B., Fernandez D.U. The utility of ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionisation time-of-flight mass spectrometry for multi-residue determination of pesticides in strawberry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2008; 22(17): 2731−46. https://doi.org/10.1002/rcm.3671Huang J., Liu H., Gu W., Yan Z., Xu Z., Yang Y., et al. A delivery strategy for rotenone microspheres in an animal model of Parkinson’s disease. Biomaterials. 2006; 27: 937−46. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2005.07.005Huang J., Liu H., Gu W., Yan Z., Xu Z., Yang Y., et al. A delivery strategy for rotenone microspheres in an animal model of Parkinson’s disease. Biomaterials. 2006; 27: 937−46. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2005.07.005Черных И.В, Щулькин А.В., Мыльников П.Ю., Гацанога М.В., Есенина А.С., Градинарь М.М., Якушева Е.Н. Функциональная активность гликопротеина-P в гематоэнцефалическом барьере на фоне экспериментального паркинсонического синдрома. Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2019; 27(2): 150−9. https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2019272150-159Chernykh I.V., Shchulkin A.V., Mylnikov P.Y. Functional activity of p-glycoprotein in blood-brain barrier during experimental parkinson’s syndrome. Rossijskij mediko-biologicheskij vestnik imeni akademika I.P. Pavlova. 2019; 27(2): 150–9. https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2019272150-159 (in Russian)Мыльников П.Ю., Черных И.В., Щулькин А.В., Попова Н.М., Якушева Е.Н. ВЭЖХ-методика количественного анализа фексофенадина в печени кроликов. Фармация и фармакология. 2020; 8(1): 40–7. https://doi.org/10.19163/2307-9266-2020-8-1-40-47Mylnikov P.Yu., Chernykh I.V., Shchulkin A.V., Popova N.M., Yakusheva E.N. HPLC-methods of fexofenadine quantitative analysis in rabbits’ liver. Farmaciya i farmakologiya. 2020; 8(1): 40–47. https://doi.org/10.19163/2307-9266-2020-8-1-40-47 (in Russian)

The authors declare that there are no conflicts of interest present.