Введение

Препараты на основе обратимых ингибиторов холинэстераз всё шире используются в современной фармакологии. Применение такрина (из группы третичных аминов) при болезни Альцгеймера ранее продемонстрировало свою эффективность и было прекращено только из-за проявлений гепатотоксичности [1]. Галантамин, ещё один представитель группы третичных аминов, и ныне применяется при комплексной терапии болезни Альцгеймера, а также полиневрита, полиомиелита и миастении. В последнее десятилетие активно разрабатываются и внедряются фармакологические средства на основе соединений из группы карбаматов [2]. В частности, в 2020 г. разработан и запатентован фенилкарбамат (патент РФ № 2754133), предлагаемый для лечения отравлений антидепрессантами, фосфорорганическими и холинотропными соединениями. Ценобамат, положительный аллостерический модулятор ГАМКА-рецепторов и потенциалзависимый блокатор натриевых каналов [3], активно внедряется за рубежом в клиническую практику, в том числе при лечении болезни Альцгеймера. Однако необходимо учитывать, что обратимые ингибиторы холинэстераз токсичны, их передозировка может вызывать типичный холинэргический криз с развитием генерализованного судорожного синдрома и стойких неврологических нарушений. При этом известно, что, помимо сходного с фосфорорганическими соединениями механизма действия на ацетилхолинэстеразу (АХЭ), заключающегося в ингибировании её центра взаимодействия с ацетилхолином, существуют и нехолинэргические проявления интоксикации, различающиеся в зависимости от типа соединения [4–6]. Многие исследователи сходятся во мнении, что ни одна экспериментальная модель судорожного синдрома не отражает в полной мере  всего спектра проявлений острой интоксикации различными соединениями [7–10].

С учётом вышеизложенного целью данного исследования было сравнительное изучение проявлений судорожного синдрома в эксперименте на животных с применением различных обратимых ингибиторов холинэстераз как модельных токсикантов.

Материал и методы

В качестве судорожных агентов для внутрибрюшинного (в/б) введения лабораторным животным (крысам) применяли следующие вещества.

Такрин (9-амино-1,2,3,4-тетрагидроакридин, C13H14N2) из группы третичных аминов, обратимый ингибитор АХЭ центрального действия. Ранее использовался в клинической практике для лечения болезни Альцгеймера. Для моделирования судорог такрин (ЛД50 = 14,0 ± 0,9 мг/кг м. т. при внутрибрюшинном введении) вводили в судорожной дозе 15 мг/кг м. т., подобранной по результатам предварительных экспериментов. Далее эти животные обозначаются как группа Такрин.

Галантамин ((4aS,6R,8aS)-4a,5,9,10,11,12-Гексагидро-3-метокси-11-метил-6H-бензофуро[3a,3,2-ef][2]бензазепин-6-ол, C17H21NO3) из группы третичных аминов, обратимый ингибитор АХЭ центрального действия. Применяется в клинической практике для лечения болезни Альцгеймера. Для моделирования судорог галантамин (ЛД50 = 26,8 ± 2,2 мг/кг при внутрибрюшинном введении) вводился в судорожной дозе 25 мг/кг м. т., подобранной по результатам предварительных экспериментов. Далее эти животные обозначаются как группа Галантамин.

Фенилкарбамат (гидрохлорид замещённого  2-[(демитиламино)метиларилдемитилкарбамата, C7H7O2N) из группы карбаматов, обратимый ингибитор АХЭ центрального действия. Для моделирования судорог фенилкарбамат применяли в установленной ранее дозе (1 мг/кг м. т.), способной индуцировать выраженный судорожный синдром с минимальным процентом летальности [11]. Далее эти животные обозначаются как группа Фенилкарбамат.

Химически чистые модельные токсиканты были синтезированы в лаборатории синтеза лекарственных препаратов ФГБУ НКЦТ им. С.Н. Голикова ФМБА России.

В качестве отрицательного контроля применяли воду для инъекций.

Эксперименты in vivo проводились на лабораторных животных (половозрелых крысах-самцах) с массой тела 200–240 г (НИЦ «Курчатовский институт» – питомник «Рапполово», Ленинградская область). Животных содержали в стандартных условиях: по 6 особей в поликарбонатных клетках на подстиле при температуре плюс 22 ± 3 °C и относительной влажности воздуха 30–70%, световой режим (день/ночь) – 12/12. Питание – полнорационный корм для грызунов, вода – ad libitum.

В эксперименте животных распределяли по группам методом стратификации с использованием в качестве основного критерия массы тела. Предварительную оценку острой токсичности ингибиторов холинтеэстераз осуществляли для определения полулетальной дозы (ЛД50) по методу В.Б. Прозоровского [12].

Выраженность судорожного синдрома в эксперименте оценивали по шкале Racine [13–15] с модификациями в шести уровнях исходя из особенностей развития судорожного синдрома, вызываемого обратимыми ингибиторами холинэстеразы:

Продолжительность судорожного синдрома измеряли в минутах. Летальность оценивали по доле погибших крыс от общего количества в исследуемой группе после введения судорожного агента в течение суток наблюдения.

Физиологические тесты проводили на следующий день после внутрибрюшинного введения животным обратимых ингибиторов холинэстераз.

Физиологический тест «открытое поле» проводили с помощью автоматической системы VideoMot 2, TSE (Германия). Регистрировали в течение двух минут наблюдения вертикальную активность (стойки), груминг, скорость движения животных и расстояние, пройдённое животным в течение эксперимента, общую двигательную активность, количество движений в центре площадки и на периферии.

Физиологический тест «сила хвата» проводили с применением прибора для определения силы хвата Gripstrengthmeter 303500 series, TSE (Германия). Регистрировали максимальную силу (p), прикладываемую животным при отпускании решётки, на которой установлен высокочувствительный датчик. Измерения повторяли три раза, медианное значение использовали для статистической обработки результатов.

Физиологический тест «экстраполяционное избавление» проводился с применением установки, представляющей собой цилиндрическую ёмкость с водой (диаметр 35 см, высота 40 см), наполненную водой с температурой 22 °С на глубину 17,5 см от дна. В центре сосуда укреплён прозрачный стеклянный цилиндр (диаметр 9 см, высота 22 см), нижний край которого погружён в воду на глубину 2,5 см. Крыс помещали внутрь цилиндра хвостом вниз. На протяжении двух минут регистрировали число безуспешных попыток избегания, реализуемых в форме прыжков, и латентный период подныривания. После совершения подныривания (или, в случае отсутствия подныривания, – по истечении срока тестирования) животное извлекали из установки.

Физиологический тест «условная реакция пассивного избегания болевого раздражения» (УРПИ) для оценки когнитивных функций проводили, регистрируя параметры через 2 и 24 ч после обучения в двухкамерной установке PACS-30 (Columbus Instruments, США). Учитывали параметры: время первого посещения темной камеры (до обучения для оценки наличия у животного норкового рефлекса), латентный период захода в тёмную наказуемую камеру, время пребывания в светлой и тёмной камерах. Общее время эксперимента для каждого животного – 120 с.

Для гистологического анализа выполняли эвтаназию животных и извлечение головного мозга. Образцы тканей были вырезаны, обезвожены, пропитаны парафином. Приготовленные срезы окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали методом световой микроскопии с использованием микроскопа Leica DM1000 (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Германия).

Массовые коэффициенты головного мозга определяли как отношение массы органа к массе тела, выраженное в ‰.

Для математико-статистического анализа результатов использовали пакет Statistica 10.0. Рассчитывали следующие описательные статистики количественных показателей: медиана (Me), верхняя (UQ) и нижняя (LQ) квартили. Также приводили количество наблюдений (N). Для сравнения нескольких независимых выборок, представленных количественными переменными, применяли ранговый анализ вариаций по Краскелу – Уоллису (Kruskel–Wallis ANOVA). В случае установления статистически значимых различий между всеми группами для выявления различий между отдельными группами использовали апостериорный метод «Сравнение средних рангов для всех групп» (непараметрический Dunn test), учитывающий проблему множественных сравнений. Для сравнения качественных показателей (долей) и оценки статистической значимости обнаруженных различий в частоте их появления использовали точный критерий Фишера (Fisher exact test). Полученное р-значение для подтверждения нулевой гипотезы должно было превышать 0,05.

Результаты

Согласно полученным результатам наблюдений, общая клиническая картина интоксикации изученными обратимыми ингибиторами холинэстераз была схожа. Через 2–5 мин после введения у животных наблюдалось снижение двигательной активности, пилоэрекция, саливация и лакримация, появлялись жевательные движения, а также подёргивания усов и ушей. Далее начинал развиваться судорожный синдром, выражавшийся в появлении вздрагиваний, синдрома Штрауба и генерализованном треморе, крысы при этом находились в вытянутом лежачем положении. Через 5–15 мин начали проявляться клонические судороги и эпизоды клонико-тонических судорог. У некоторых животных наблюдались проявления хромодакриорреи, а также хрипы в лёгких.

Смертность животных оценивали в течение суток, но, как правило, гибель наступала в течение первых двух часов после начала судорог. При введении фенилкарбамата гибель животных не наблюдалась (табл. 1), гибель животного из группы Галантамин наступила через 20 мин, ещё одного – через два часа после введения, при введении такрина зафиксировано две гибели животных в пределах 30 и 40 мин соответственно.

При оценке влияния ингибиторов холинэстераз на выраженность судорожного синдрома судороги 4-го уровня и выше по модифицированной шкале Racine, эквивалентные генерализованным клонико-тоническим судорогам у человека, во всех группах развивались с пятой минуты. После введения фенилкарбамата доля крыс с выраженными судорогами начинала снижаться с 40-й минуты и 95 мин таких животных не наблюдали. При введении такрина количество крыс с выраженными судорогами начинало снижаться с 90-й минуты и только ближе к двум часам судорог 4-го уровня не наблюдали. При воздействии галантамина (в отличие от фенилкарбамата и такрина) доля крыс с выраженными судорогами снижалась до 0 в период от 30 до 40 мин.

Результаты сравнительной оценки временных показателей судорог у самцов крыс с применением Kruskel-Wallis ANOVA (табл. 2) показали статистически значимые различия между всеми исследуемыми группами как по латентному периоду (р = 0,000), так и по продолжительности судорог (р = 0,007).

При анализе отличий с использованием Dunn test выявлены достоверные различия (р = 0,003) между группами Галантамин и Фенилкарбамат: латентный период в первом случае (галантамин) был короче на 60%. Также зарегистрированы отличия при введении такрина и галантамина (р = 0,000): у экспериментальных животных из группы Такрин латентный период был дольше на 70%.

По продолжительности судорог животные группы Галантамин значимо не отличалась от группы Фенилкарбамат, однако статистически значимые различия (р = 0,020) установлены для группы Такрин: продолжительность судорог у животных в этой группе была дольше на 77%. Также статистически значимая (р = 0,022) более короткая (на 53%) продолжительность судорог установлена в группе Галантамин по сравнению с животными группы Такрин.

На рис. 1 (см. на вклейке) представлена динамика медианных значений балльной оценки судорожного синдрома после введения обратимых ингибиторов холинэстераз.

С целью интегральной оценки динамики изменений выраженности судорог для каждого животного в представленных временных точках рассчитывали взвешенную по времени сумму баллов интенсивности судорог (ВВСБ), представляющую собой площадь под кривой «судороги в баллах – время» (из расчётов были исключены погибшие особи). Результаты сравнительной оценки переменной площади под кривой «судороги в баллах – время» с применением непараметрических методов не показали статистически значимых различий между группами.

Проведённая на следующий день после внутрибрюшинного введения модельных токсикантов самцам крыс сравнительная межгрупповая оценка поведенческих реакций в тестах «открытое поле» и «сила хвата» не показала статистически значимых различий, однако наблюдалась недостоверная тенденция к снижению как вертикальной двигательной активности, так и горизонтальной у животных, получивших обратимые ингибиторы холинэстераз. Расстояние, пройдённое животными, и скорость движения также были снижены относительно контрольной группы на 6–14%. Аналогичная тенденция отмечалась и при определении силы хвата крыс.

Сравнительная оценка показателей памяти и обучаемости в тесте «экстраполяционное избавление» самцов крыс через 24 и 48 ч после введения обратимых ингибиторов холинэстеразы не выявила значимых различий.

При проведении гистологического исследования головного мозга сразу после воздействия фенилкарбамата, такрина, галантамина зафиксированы отдельные отклонения от нормы в коре головного мозга: выраженное расширение периваскулярных и перицелюллярных пространств (3–5 случаев в группе), появление тёмных и (в единичных наблюдениях) сморщенных нейронов (3–7 в группе). Также обнаружено повреждение гиппокампа в ряде случаев. Наиболее типичные примеры изменений представлены на рис. 2 (см. на вклейке).

Сравнительная оценка массовых коэффициентов головного мозга через 48 ч после введения обратимых ингибиторов холинэстеразы самцам крыс показала отсутствие статистически значимых различий, однако зафиксирована недостоверная тенденция к снижению данного показателя у животных, получавших обратимые ингибиторы холинэстеразы, по сравнению с контролем. При этом наименьший средний результат наблюдался в группе, получавший галантамин, отличавшейся самой короткой длительностью судорожного синдрома в эксперименте.

Обсуждение

В данном исследовании в качестве тест-системы были использованы крысы как предпочтительный в токсикологических исследованиях вид грызунов. Количество животных, использованных в исследовании, было ограничено необходимостью соответствия биоэтическим принципам и требованием достаточного количества для статистически достоверных результатов: 10 особей в каждой группе. Соответствие исследования биоэтическим нормам подтверждено положительным заключением биоэтической комиссии ФГБУ НКЦТ им. С.Н. Голикова ФМБА России.

Полученные результаты сравнительного изучения проявлений интоксикации обратимыми ингибиторами холинэстераз убедительно продемонстрировали, что, несмотря на сходные механизмы прямого действия на организм (ингибирование активности АХЭ), характеристики судорожного синдрома могут различаться. В частности, такрин и галантамин, будучи третичными аминами центрального действия, значительно различались и по длительности судорог у животных, и по латентному периоду при введении в эксперименте.

Установленная смертность в группах животных, получавших такрин и галантамин, объясняется тем, что выбранные судорожные дозы были близки к значению ЛД50. Тем не менее в группе, получившей такрин, обе смерти произошли в близкий временной отрезок, что, с учётом сходной летальности при меньшей дозе, подтверждает его большую токсичность в сравнении с галантамином.

Отдельный интерес представляют результаты гистологических исследований в сопоставлении с результатами оценки физиологических тестов: несмотря на отсутствие выраженных изменений в тканях мозга у отдельных животных, зафиксирован ряд изменений в поведении, более выраженных в группе Галантамин, что характеризует возможное начало неврологических нарушений. Необходимо отметить, что даже в случае интоксикации необратимыми ингибиторами холинэстераз в составе боевых отравляющих веществ у исследователей нет единого мнения, являются ли формирующиеся у выживших когнитивные нарушения прямым последствием интоксикации или посттравматического стресса [16, 17]. Однако опубликованы сообщения о том, что после острой интоксикации у выживших часто наблюдаются тремор, головокружения, головные боли, частичная потеря памяти, эмоциональная лабильность, спутанность сознания, когнитивные нарушения, периферическая нейропатия и вегетативная дисфункция [18, 19]. Полученные данные вкупе с результатами, полученными ранее другими исследователями, подтверждают теорию комплексного воздействия обратимых ингибиторов холинэстераз на организм. Можно предположить, что часть нарушений здоровья опосредованы не прямым токсическим эффектом обратимых ингибиторов холинэстераз, а их опосредованным влиянием на органы и системы вследствие оксидативного стресса, нейровоспаления и демиелинизации с прогрессирующим развитием аутореактивных процессов в головном мозге пострадавших через 14 и более дней после прямого воздействия токсиканта [20]. Это обосновывает необходимость всестороннего тестирования новых лекарственных средств на основе обратимых ингибиторов холинэстераз, в том числе создания экспериментальных моделей для оценки отложенных неврологических нарушений в доклинических исследованиях безопасности. Также необходима разработка оптимальных средств купирования судорог и профилактики неврологических нарушений в случае передозировки подобных средств.

Заключение

Фармакологически активные соединения из группы обратимых ингибиторов холинэстераз при введении в организм в судорожной дозе демонстрируют ряд различий и по основным параметрам судорожной активности, и по влиянию на поведение животных в эксперименте. Следовательно, при разработке и доклиническом исследовании средств купирования острых и профилактики отложенных проявлений интоксикации соединениями данной группы необходимо создавать экспериментальные модели, позволяющие всесторонне оценить проявления токсичности.