Введение

В профилактической токсикологии проблема возможного развития отдалённых эффектов у человека при контакте с различными химическими веществами является одной из наиболее значимых [1–3]. Среди разнообразных видов отдалённых последствий ведущее место занимает нарушение репродуктивной функции, влияющее как на состояние здоровья контактирующих, так и на воспроизводимость и полноценность потомства, что влечёт за собой серьёзные социальные и экономические последствия [4]. Поскольку в производстве, хранении и применении химических веществ разной степени токсичности заняты преимущественно мужчины, при разработке мер профилактики отдалённых последствий основное внимание следует уделять изучению влияния этих соединений на мужскую половую функцию [5– 9].

В то же время вопрос о рассматриваемом виде гонадотоксических свойств несимметричного диметилгидразина (компонента ракетных топлив) в условиях его длительного перорального поступления в организм практически не изучен. В связи с этим цель работы заключалась в экспериментальной оценке особенностей хронического внутрижелудочного воздействия несимметричного диметилгидразина (НДМГ) на мужскую репродуктивную функцию с установлением пороговой и максимальной недействующей доз.

Материал и методы

В качестве объекта настоящего исследования использован несимметричный диметилгидразин (гептил, 1,1-диметилгидразин (CH3)2N2H2, САS № 57-14-7) с массовой долей 99% и удельной плотностью d4²⁰ = 0,7914 г/см³. Данное соединение представляет собой бесцветную или слегка желтоватую жидкость с резким сильно раздражающим аммиачным запахом. Гептил хорошо растворяется в воде [10].

При выборе уровней воздействия НДМГ принимали во внимание результаты ранее выполненных исследований по установлению порога хронического общетоксического действия [11]. Основываясь на этих данных при постановке опыта тестируемое соединение ежедневно в течение шести месяцев вводили самцам крыс трёх опытных групп в следующих дозах: 4 · 10−⁴ мг/кг – 1-я опытная группа; 8 · 10−⁵ мг/кг – 2-я опытная группа и 1,5 · 10−⁵ мг/кг – 3-я опытная группа

В эксперименте использовали 40 белых нелинейных самцов крыс (по 10 особей в трёх опытных и контрольной группах) и 45 самок (11–12 животных в каждой группе). Оценку состояния генеративной функции самцов каждой группы проводили с применением комплекса общепринятых методов¹,² по окончании указанного периода воздействия НДМГ.

Содержание, питание, уход за животными и их умерщвление осуществляли согласно требованиям профильного ГОСТ 33215–2014 и принципам гуманного обращения с экспериментальными грызунами³.

В ходе эксперимента самцов еженедельно взвешивали для учёта прироста массы тела и соответствующей корректировки вводимых объёмов растворов ксенобиотика. Водные растворы токсиканта готовили ежедневно непосредственно перед введением подопытным особям в желудок при помощи зонда из расчёта 1 мл на 100 г массы тела. Особи контрольной группы получали равные объёмы дистиллированной воды.

Схема обследования животных сводилась к следующему. За пять дней до окончания периода поступления токсиканта с целью определения способности к спариванию (интегральная характеристика половой активности) и полноценному оплодотворению самцов всех групп индивидуально подсаживали к интактным самкам, находившимся в фазе эструса, в соотношении 1 : 2. О результатах спаривания судили по наличию сперматозоидов в вагинальных мазках самок. Замену самок проводили ежедневно до полной комплектации необходимых статистических групп. На 21-й день установленного срока беременности самок умерщвляли дислокацией шейных позвонков, вскрывали брюшину, извлекали плоды для дальнейшего исследования.

Микроанатомическое исследование плодов по модифицированным методикам Даусона и Вильсона проводили для диагностики аномалий развития внутренних органов и костной системы (наличие тератогенного эффекта⁴ [12, 13].

Самцов по завершении периода спаривания подвергали эвтаназии методом декапитации, извлекали семенники с хвостовой частью придатков для последующего анализа функционального состояния сперматозоидов (осмотическая и кислотная резистентность, время подвижности, количество активных форм и общее количество гамет) и морфоструктур их гонад (наличие атрофий и слущиваний сперматогенного эпителия, индекс сперматогенеза, количество сперматогоний и канальцев с 12-й стадией мейоза)².

Полученные результаты экспериментов в зависимости от вида эмпирического распределения анализируемых показателей обрабатывали с применением параметрических и непараметрических статистических методов. Для обработки градированных признаков с непрерывным распределением применяли пакет Primer of Biostatistics 7.0 с использованием t-критерия Стьюдента (различия считали достоверными при p ≤ 0,05). Анализ показателей, имеющих дискретное распределение и оцениваемых в альтернативной форме (индексы оплодотворения, частота аномалий развития), проводили с помощью критерия j углового преобразования Фишера [14].

Результаты

Установлено, что все самцы как опытных, так и контрольной групп проявили способность к спариванию с интактными самками. Кроме того, проходившее во всех группах практически в равные сроки формирование групп условно оплодотворённых животных свидетельствует об отсутствии нарушений со стороны половой активности подопытных крыс. Не отмечено статистически значимых межгрупповых различий при расчёте индексов оплодотворения. Последующая оценка средней численности плодов, приходящихся на одну самку, их массы не выявила видимых отличий оцениваемых показателей от аналогичных значений в контроле. Однако при определении длины плодов в первой опытной группе зарегистрировано достоверное снижение данного показателя (табл. 1).

Дальнейшее исследование плодного материала на наличие тератогенного эффекта, проведённое по методу Вильсона, позволило установить, что и в опытных, и в контрольной группах присутствовали немногочисленные отклонения в развитии отдельных плодов. Тем не менее статистически значимых межгрупповых отличий не зафиксировано, что характеризует выявленные сдвиги как спонтанные. Кроме того, макроскопическое исследование просветлённых плодов по методу Даусона не выявило нарушений процессов остеогенеза. Анализ спермограммы подопытных животных позволил установить, что хроническое воздействие НДМГ не оказывало токсического влияния на функциональную активность зрелых гамет. Об этом свидетельствуют достаточно ровные показатели осмотической и кислотной резистентности половых клеток в группах (табл. 2).

Также при определении численности подвижных форм сперматозоидов, времени активной подвижности, общего их количества у подопытных крыс не обнаружено существенных отклонений значений указанных показателей от контроля. Визуальная оценка состояния семенников подопытных особей показала отсутствие каких-либо изменений. Последующий расчёт относительной массы не выявил значимых межгрупповых различий данного показателя (см. табл. 2).

Изучение сперматогенеза крыс всех групп не выявило массовых атрофий и слущивания семяродного эпителия в семенных канальцах. Тем не менее при подсчёте количества сперматогоний у самцов, получавших соединение в наивысшей дозе, зафиксировано статистически значимое уменьшение сперматогоний по сравнению с контролем. Кроме того, у особей данной группы выявлено достоверное снижение индекса сперматогенеза (см. табл. 2).

Обсуждение

Обобщённая оценка полученных данных показала, что шестимесячное пероральное поступление НДМГ в дозах 4,0 · 10−⁴; 8,0 · 10−⁵ и 1,5 · 10−⁵ мг/кг не снижало способности самцов к спариванию и оплодотворению, не влияло на показатели спермограммы и не обнаруживало у потомства тератогенного эффекта.

В то же время длительное воздействие соединения в максимальной дозе способствовало существенному снижению количества сперматогоний в семенниках подопытных крыс и достоверному уменьшению числа слоёв сперматогенного эпителия. Также у потомства самцов данной группы выявлено проявление эмбриотоксичности, реализованное в значимом снижении их краниокаудального размера.

Анализ возможных причин установленных нарушений позволяет рассматривать в качестве наиболее очевидной ранее обнаруженную способность НДМГ преодолевать гематотестикулярный барьер и проникать в эпителиальные канальцы гонад лабораторных животных [15, 16]. При этом следует отметить, что тестируемое соединение оказывало как прямое токсическое воздействие на развивающиеся половые клетки, сопровождавшееся последующим изменением числа слоёв сперматогенного эпителия, так и опосредованное негативное влияние на генетический аппарат гамет, что реализовалось в присущей данному соединению особенности нарушать нормальное развитие потомства, находящегося на антенатальной стадии развития [17, 18].

Ограничения исследования. Экспериментальное исследование хронического перорального воздействия гептила на мужскую репродуктивную функцию не предусматривает оценки других отдалённых последствий.

Заключение

На основании комплекса обнаруженных изменений пороговой дозой хронического внутрижелудочного воздействия несимметричного диметилгидразина на репродуктивную функцию самцов крыс признана величина, равная 4,0 · 10−⁴ мг/кг, а максимальной недействующей – 8,0 · 10−⁵ мг/кг.

Выявленные особенности негативного влияния несимметричного диметилгидразина учтены при обосновании его ПДК в воде водоёмов.

¹ Методы экспериментального исследования по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования: метод. рекомендации. М-во здравоохранения СССР, Гл. сан.-эпидемиол. упр. [Сост. д. м. н., проф. И.В. Саноцкий, к.м.н. В.Н. Фоменко, к. т. н. Л.С. Сальникова и др.]. Москва: МЗ СССР, 1978. 35 с.

² Методические указания по изучению гонадотоксического действия химических веществ при гигиеническом нормировании в воде водоемов : утв. и введ. в действие 5 ноября 1981 г. начальником санитарно-эпидемиологического управления Минздрава СССР В.Е. Ковшило. под ред. Г.Н. Красовского. М. : МЗ СССР, 1981. 23 с.

³ ГОСТ 33044–2014. Принципы надлежащей лабораторной практики. М.: Стандартинформ, 2014.

⁴ Методические указания по изучению эмбриотоксического действия фармакологических веществ и влияния их на репродуктивную функцию : утв. и введ. в действие 14 марта 1986 г. А.П. Дыбан, Н.М. Смольникова, А.М. Торчинский [и др.]. М. : МЗ СССР, 1986. 24