Обоснование гигиенического норматива содержания в воздухе рабочей зоны фармацевтической субстанции клиндамицина гидрохлорида с учётом его токсических свойств, подтверждённых в хроническом ингаляционном эксперименте

Введение

Антибактериальные лекарственные средства составляют значительную часть номенклатуры производимой фармацевтической продукции и широко применяются в медицине и ветеринарии. Рост объёмов их промышленного производства сопровождается увеличением числа работников, подвергающихся профессиональному воздействию, что обусловливает необходимость комплексной оценки рисков для здоровья работающих и разработки гигиенических нормативов и методов контроля содержания антибактериальных лекарственных средств в воздухе рабочей зоны [1–4].

В общем объёме производимых в Республике Беларусь антибактериальных лекарственных средств значительную долю составляет клиндамицина гидрохлорид (КГ) – полусинтетический антибиотик группы линкозамидов, обладающий высокой терапевтической значимостью и применяемый для лечения инфекционно-воспалительных болезней, вызванных чувствительными к нему штаммами микроорганизмов [5–6].

Цель работы – изучение в хроническом эксперименте при ингаляционном воздействии токсического действия фармацевтической субстанции КГ и обоснование её предельно допустимой концентрации в воздухе рабочей зоны (ПДКврз).

Материал и методы

Токсическое действие фармацевтической субстанции КГ изучали в снижающихся концентрациях в условиях хронического ингаляционного воздействия на нелинейных белых крыс [7]. До эксперимента животные находились в карантине в течение 14 дней в условиях вивария. Группы (три экспериментальных и одна контрольная, по 10 крыс в каждой) формировали методом случайной выборки, разность в массе животных составила не более 10% [7, 8].

Схема эксперимента предполагала ежедневное (5 дней в неделю) ингаляционное поступление КГ в течение четырёх месяцев в следующих концентрациях: первая опытная группа животных – 13,5 мг/м³, вторая – 4,4 мг/м³, третья – 1,6 мг/м³. Выбор концентраций обоснован результатами изучения специфического действия КГ в субхронических ингаляционных экспериментах [9–13].

Для оценки токсического действия КГ на основные органы и системы определяли массу тела животных, относительные коэффициенты массы внутренних органов (ОКМ), суммационно-пороговый показатель (СПП), двигательную активность с использованием теста «открытое поле». После завершения эксперимента белых крыс выводили из опыта методом мгновенной декапитации, проводили макроскопическое и гистологическое исследование внутренних органов для выявления морфологических признаков токсического действия и определения органов-мишеней, исследовали показатели периферической крови, биохимические параметры сыворотки крови и функциональное состояние мочевыделительной системы. В процессе микроскопического исследования анализировали наличие или отсутствие патологических процессов в гистологических срезах органов крыс. Воспалительную инфильтрацию оценивали полуколичественным способом с указанием степени её выраженности: слабая, умеренная и выраженная.

Манипуляции с лабораторными животными проводили в соответствии с принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 18 марта 1986 г.), директивы Европейского парламента и Европейского Союза по охране животных, используемых в экспериментах 2010/63/EU, и на основании разрешения, выданного комиссией по биоэтике Республиканского унитарного предприятия «Научно-практический центр гигиены» от 29.03.2022 г. № 2.

Экспериментальные данные обрабатывались с использованием лицензионного программного обеспечения Statistica 10. Значимость наблюдаемых различий двух независимых групп оценивали с помощью непараметрического критерия Манна – Уитни (Mann–Whitney U-test). Данные представлены в виде медианы (Ме), 25-го и 75-го процентилей, различия считались статистически значимыми при p < 0,05. Выявленные качественные микроскопические изменения органов представлены в относительных значениях (%), количественные – в виде медианы (Ме), 25-го и 75-го процентилей.

Результаты

По результатам исследования токсического действия КГ после завершения четырёхмесячного хронического ингаляционного эксперимента установлено, что величины изученных физиологических (масса тела, СПП) и этологических показателей индивидуального поведения белых крыс всех трёх опытных групп не имели существенных различий с таковыми в контрольной группе. При этом лишь воздействие максимальной изученной концентрации вызывало у животных первой опытной группы увеличение абсолютной и относительной массы печени (р < 0,05) при отсутствии статистически значимых различий величин ОКМ других внутренних органов по сравнению с таковыми у крыс контрольной группы.

Со стороны изученных гематологических показателей также только у животных первой опытной группы установлено увеличение количества лейкоцитов на 16% (р < 0,05), в основном за счёт значительного увеличения количества моноцитов – на 34,5% (р < 0,01) по сравнению с контрольной группой.

При анализе биохимических показателей сыворотки крови у животных опытных групп выявлен ряд статистически значимых изменений. Так, воздействие КГ в максимальной изученной концентрации вызывало увеличение в сыворотке крови крыс первой опытной группы содержания мочевины на 50,5% по сравнению с контрольной группой (с 4,12 мМоль/л до 6,20 мМоль/л), что указывает на возможные нарушения функции почек и усиление протеолиза белка.

Одним из ключевых биохимическим маркёров функционального состояния печени является билирубин, который участвует в метаболизме гемсодержащих белков. Установлено увеличение содержания в сыворотке крови животных первой опытной группы общего билирубина в 3,7 раза (р < 0,05), а у крыс второй опытной группы – на 80,1% (р < 0,05) по сравнению с контролем. Повышение уровня билирубина свидетельствует о возможном гемолизе эритроцитов и нарушении функций печени, что подтверждается литературными данными о гепатотоксичности линкозамидов [14]. В то же время отмечено снижение в сыворотке крови опытных животных первой и второй групп уровня прямого билирубина соответственно на 67,3% (р < 0,05, с 0,52 мкмоль/л до 0,17 мкмоль/л) и 61,5% (р < 0,05, с 0,52 мкмоль/л до 0,20 мкмоль/л) по сравнению с контролем, что может указывать на дисфункцию гепатоцитов и нарушение конъюгации билирубина в печени.

О нарушении липидного обмена в организме экспериментальных животных после воздействия КГ в концентрации 13,5 мг/м³ свидетельствует  снижение в сыворотке крови уровня холестерина на 21,4% (р < 0,05), что, возможно, обусловлено токсическим действием препарата на метаболизм желчных кислот в печени.

Не выявлено существенного влияния КГ в испытанных концентрациях на функциональное состояние мочевыводящей системы животных, поскольку не установлены достоверные изменения изученных показателей мочи животных всех опытных групп по сравнению с контролем.

При этом длительное ингаляционное воздействие КГ в наименьшей изученной концентрации на уровне 1,6 мг/м³ не вызывало у крыс третьей опытной группы статистически значимых изменений всех изученных морфофункциональных показателей по сравнению с контрольной группой.

По завершении эксперимента выполнены патоморфологические исследования внутренних органов крыс контрольной и опытных групп. У крыс первой опытной группы наблюдались изменения гистоморфологической картины сердца, свидетельствовавшие о нарушении клеточного метаболизма: отчётливая дистрофия кардиомиоцитов, проявляющаяся неоднородностью цитоплазматического окрашивания, локальными участками гиперхромии и гипохромии ядер. У 40% животных выявлены участки контрактурных изменений мышечных волокон, что указывало на развитие ишемически-дистрофических процессов в миокарде.

У животных второй опытной группы подобные патологические изменения наблюдались в минимальной степени, а у крыс третьей опытной группы гистологическая характеристика сердца была аналогична таковой у контрольных животных.

В лёгочной паренхиме и бронхах крыс первой опытной группы выявлена выраженная гиперплазия бокаловидных клеток, сопровождаемая значительным снижением числа функционирующих реснитчатых клеток, что может приводить к нарушению мукоцилиарного клиренса (рис. 1, а, см. на вклейке).

При этом в подслизистой основе трахеи и бронхов отмечены признаки воспалительной инфильтрации, преимущественно лимфоцитарно-макрофагального характера, а в лёгочной паренхиме – периваскулярная и перибронхиальная инфильтрация, утолщение межальвеолярных перегородок (рис. 2, а, см. на вклейке).

У белых крыс второй опытной группы в лёгких определены менее выраженные изменения, характеризующиеся умеренной инфильтрацией подслизистого слоя бронхов и незначительной гиперплазией бокаловидных клеток, минимальным утолщением межальвеолярных перегородок лёгочной паренхимы (рис. 2, б, см. на вклейке).

Морфологическое исследование почечной ткани экспериментальных животных выявило дозозависимые патологические изменения, затрагивающие как клубочковый, так и канальцевый аппараты. Так, в почках животных первой опытной группы отмечено выраженное утолщение базальной мембраны капилляров клубочков (рис. 3, а, б, см. на вклейке), сопровождаемое признаками дистрофии эпителия проксимальных извитых канальцев: вакуолизация цитоплазмы, деструкция апикального полюса клеток и наличие гиалиновых капель в просвете канальцев. Эти изменения свидетельствуют об усиленной экскреции белков и нарушении процессов реабсорбции.

У животных, подвергшихся воздействию КГ в концентрации 4,4 мг/м³, выявлены менее выраженные изменения в почках: очаговая зернистая дистрофия эпителия проксимальных канальцев, умеренная вакуолизация цитоплазмы и незначительное утолщение базальной мембраны клубочков.

Воздействие максимально изученной концентрации 13,5 мг/м³ вызывало у опытных крыс гиалиново-капельную и (или) мелкокапельную жировую дистрофию гепатоцитов, а также признаки разобщённого окисления, характеризующиеся неравномерной вакуолизацией цитоплазмы (рис. 4, а, б, в, см. на вклейке). Воспалительная инфильтрация в портальных трактах выявлена у 80% животных, а у 20% отмечены признаки начального фиброза. В печени белых крыс второй опытной группы наблюдались лишь единичные дистрофические изменения.

У животных первой опытной группы выявлена значительная морфологическая перестройка лимфоидной ткани селезёнки (гипоплазия отдельных лимфофолликулов и гиперплазия других), что свидетельствовало о напряжении иммунного ответа. Красная пульпа селезёнки характеризовалась полнокровием синусоидов и снижением клеточной плотности. У белых крыс второй опытной группы изменения в селезёнке были менее выражены и ограничивались очаговой гиперплазией маргинальной зоны лимфоидных фолликулов белой пульпы.

У животных третьей опытной группы после хронического ингаляционного воздействия КГ в концентрации 1,6 мг/м³ каких-либо патологических изменений внутренних органов не установлено.

В таблице приведены обобщённые количественные характеристики структурных изменений внутренних органов белых крыс контрольной и опытных групп. Установлены достоверные различия толщины межальвеолярных перегородок лёгких крыс после ингаляционного воздействия КГ в концентрациях 13,5 мг/м³ (р < 0,0001) и 4,4 мг/м³ (р < 0,001) по сравнению с аналогичными значениями у крыс контрольной группы. Также выявлены статистически значимые различия между животными контрольной и первой опытной групп по следующим морфологическим параметрам: периваскулярная инфильтрация в лёгких (р = 0,0122), перибронхиальная инфильтрация в лёгких (р = 0,0122), изменения клубочков почек (р = 0,0472), изменения эпителия проксимальных канальцев почек (р = 0,0122), дистрофические изменения гепатоцитов (р = 0,0472) и воспалительная инфильтрация в строме печени (р = 0,0122).

Обсуждение

Выполненными экспериментальными исследованиями установлен характер и выраженность дозозависимого токсического действия на белых крыс фармацевтической субстанции клиндамицина гидрохлорида при хроническом четырёхмесячном ингаляционном поступлении в снижающихся концентрациях.

1. В испытанной концентрации на уровне 13,5 мг/м³ препарат оказывал выраженное токсическое действие на организм белых крыс, выраженное в достоверном возрастании массы печени, значимых сдвигах ряда гематологических (увеличение количества лейкоцитов за счёт значительного возрастания количества моноцитов) и биохимических показателей сыворотки крови (повышение уровней мочевины, общего билирубина и снижение концентрации прямого билирубина и холестерина), развитии очевидных патологических изменений в лёгочной ткани (признаки интерстициального пневмонита – значительная перибронхиальная и периваскулярная воспалительная инфильтрация, утолщение межальвеолярных перегородок и гиперплазия эпителия бронхов), печени (дистрофические изменения гепатоцитов, воспалительная инфильтрация перипортальных трактов и начальные признаки фиброза), почках (признаки мембранозного гломерулонефрита – утолщение базальных мембран капилляров клубочков и выраженная дистрофия эпителия проксимальных канальцев), миокарде (дистрофические изменения кардиомиоцитов сердца) и селезёнке (гипоплазия или гиперплазия отдельных лимфофолликулов).
2. Ингаляционное воздействие КГ в концентрации 4,4 мг/м³ вызывало менее распространённые и более слабые проявления токсического действия, характеризующиеся умеренным повышением билирубина и снижением уровня холестерина в сыворотке крови, минимальными структурными изменениями в бронхах (очаговая гиперплазия бокаловидных клеток) и лёгочной паренхиме (слабовыраженная периваскулярная и перибронхиальная воспалительная инфильтрация, незначительное утолщение межальвеолярных перегородок) в сочетании с реактивными изменениями селезёнки животных.
3. У опытных животных после хронического воздействия КГ в концентрации 1,6 мг/м³ все изученные морфофункциональные показатели и гистологические характеристики внутренних органов не имели существенных различий с таковыми у контрольных животных.
4. На основании результатов ингаляционного эксперимента концентрация КГ 4,4 мг/м³ принята пороговой хронического токсического действия – более чем в три раза ниже ранее установленных величин пороговых концентраций субхронического специфического дисбиотического и аллергического действий. Это определило как критерий гигиенического нормирования КГ ведущее вредное общетоксическое действие на организм. С учётом рассчитанного коэффициента запаса (11) к пороговой концентрации хронического токсического действия обоснована ПДКврз аэрозоля клиндамицина гидрохлорида на уровне 0,4 мг/м³, что соответствует II классу опасности.

Ограничения исследования. Исследования ограничены изучением токсического действия фармацевтической субстанции КГ в хроническом эксперименте при ингаляционном воздействии. Результаты исследования применимы для обоснования предельно допустимой концентрации исследуемой субстанции в воздухе рабочей зоны (ПДКврз).

Заключение

В результате хронического ингаляционного эксперимента установлено, что концентрация КГ на уровне 13,5 мг/м³ является эффективно действующей по токсическому эффекту, концентрация КГ на уровне 4,4 мг/м³ признана пороговой по токсическому действию на организм, а концентрация 1,6 мг/м³ является недействующей.

При обосновании ПДКврз фармацевтической субстанции КГ исходили из лимитирующих порогов вредного действия на организм, установленных при изучении специфического дисбиотического и аллергического, токсического действия препарата в ингаляционных экспериментах [10, 12, 15]. При этом установленная величина пороговой концентрации хронического токсического действия КГ (4,4 мг/м³) более чем в три раза ниже ранее определённых в субхроническом ингаляционном эксперименте величин пороговых концентраций КГ по специфическому дисбиотическому (13,5 ± 0,4 мг/м³) и аллергическому (27,5 ± 0,8 мг/м³) действиям [10, 11]. Следовательно, критерием гигиенического нормирования КГ является ведущее вредное общетоксическое действие на организм. На этом основании с учётом рассчитанного коэффициента запаса [16] к пороговой концентрации хронического токсического действия обоснована ПДКврз аэрозоля клиндамицина гидрохлорида на уровне 0,4 мг/м³, что соответствует II классу опасности [16–18].