Использование технологий ex vivo для выявления ранних признаков функциональных нарушений, вызванных действием промышленных и бытовых ксенобиотиков

Введение

В условиях постоянно увеличивающейся химической нагрузки на организм человека, обусловленной воздействием низких концентраций многочисленных промышленных и бытовых ксенобиотиков, актуальной задачей современной токсикологии остаётся разработка высокочувствительных и прогностически значимых методов оценки их потенциальной опасности. В условиях длительного воздействия влияние даже низких доз ксенобиотиков может вызывать функциональные и последующие органические изменения. Включение физиологических компенсаторных механизмов, направленных на поддержание гомеостаза, приводит к тому, что функциональные изменения в организме, вызванные действием ксенобиотиков, а возможно, и продуктов их метаболизма, могут в течение длительного времени на уровне организма в целом не проявляться. В этой парадигме всё большее признание получают технологии ex vivo, позволяющие определять формирование самых ранних функциональных изменений в отсутствие системных регуляторных механизмов, количественно характеризуя действие минимальных доз промышленных и бытовых токсикантов.

В структуре общей заболеваемости персонала химически опасных объектов России болезни сердечно-сосудистой системы составляют более 11%, существенно ухудшая качество жизни и приводя к снижению и преждевременной потере трудоспособности взрослого, наиболее квалифицированного населения [1]. За период с 2019 по 2023 г. среди впервые признанных инвалидами людей в возрасте старше 18 лет 29% получили инвалидность именно в связи с болезнями системы кровообращения [2]. Это в очередной раз свидетельствует об актуальности диагностики ранних функциональных изменений сердечно-сосудистой системы для принятия своевременных решений, направленных на разработку и проведение профилактических мероприятий с целью увеличения продолжительности жизни и продления профессионального долголетия. Экспериментальные исследования с использованием технологий ex vivo становятся высокоинформативной частью комплексной токсикологической оценки ксенобиотиков.

Цель работы – оценка возможности применения тест-системы на основе изучения параметров активности изолированных мышечных органов для выявления ранних признаков функциональных нарушений, вызванных влиянием промышленных и бытовых ксенобиотиков.

Материал и методы

Экспериментальные исследования выполнены на белых крысах-самцах массой тела 300–350 г, полученных из «Питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область) филиала НИЦ «Курчатовский институт» – Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова. Животные прошли 14-дневный карантин, содержались в помещениях с постоянными параметрами микроклимата: температура плюс (20 ± 1) °С, относительная влажность воздуха (60 ± 5)%, режим освещения – 12 ч день / 12 часов ночь. Доступ к воде и корму был свободным.

Оценку информативности технологий ex vivo для выявления ранних признаков функциональных нарушений, вызываемых ксенобиотиками, выполняли на примере двух химических веществ: нитрита натрия и несимметричного диметилгидразина.

Нитрит натрия (NaNO₂, натрий азотистокислый), широко используемый в строительстве, металлургии, медицине и пищевой промышленности (пищевая добавка Е250), является веществом 3-го класса опасности (умеренно опасные): ЛД₅₀ для крыс при внутрижелудочном введении составляет 180 мг/кг массы тела (м.т.). Были сформированы три экспериментальные группы животных по 10 особей в каждой, рандомизированных по массе тела. Водный раствор нитрита натрия вводили животным опытных групп внутрижелудочно в объёме 0,5 мл ежедневно в течение 28 дней в дозах 0,028 мг/кг м.т. (группа НН-1), 0,28 мг/кг м.т. (группа НН-2), 2,8 мг/кг м.т. (группа НН-3). Выбор исследуемого диапазона доз нитрита натрия основывался на результатах ранее проведённых исследований [3] с учётом допустимого уровня суточного потребления нитрита натрия, установленного ВОЗ для человека (0,07 мг/кг м.т.).

Несимметричный диметилгидразин (НДМГ, гептил) является чрезвычайно токсичным веществом 1-го класса опасности, вызывающим отравление при любом пути поступления в организм: вдыхании паров, попадании с пищей, водой и через кожу. В основном НДМГ используется как высокоэнергетическое ракетное топливо, в двигательных установках пилотируемых кораблей и автоматических спутников, орбитальных и межпланетных станций, многоразовых космических кораблей [4]. При выборе уровней воздействия НДМГ исходили из данных литературы о пороге острого общетоксического действия при внутрижелудочном введении для белых крыс – 1,94 мг/кг м.т. (1/80 ЛД₅₀) [5], в связи с чем для субхронических экспериментов в качестве максимальной использовалась концентрация НДМГ 2,0 мг/кг м.т. Значения двух меньших уровней воздействия гептила отличались от указанной величины в 10 и 100 раз. Были сформированы три экспериментальные группы по 10 особей в каждой, животные которых получали раствор НДМГ внутрижелудочно в объёме 0,5 мл ежедневно в течение 28 дней в дозах 0,02 мг/кг м.т. (1/8000 ЛД₅₀) – группа НДМГ-1, 0,2 мг/кг м.т. (1/800 ЛД₅₀) – группа НДМГ-2, 2,0 мг/кг (1/80 ЛД₅₀) – группа НДМГ-3. Рандомизация производилась по массе тела.

В качестве контрольной группы использовались интактные животные, которые получали эквиобъёмное количество дистиллированной воды. Показатели этой группы использовали в качестве контрольных для обеих экспериментальных групп, поскольку эксперименты для двух веществ проводились одновременно.

По окончании курсового воздействия животных подвергали эвтаназии путём декапитации, после чего проводили исследование сократительной активности изолированного сердца и сегментов брыжеечных лимфатических сосудов в соответствии с ранее описанными методиками [6, 7]. Для оценки влияния субхронического применения нитрита натрия и НДМГ на устойчивость изолированного миокарда к ишемии-реперфузии проводили оценку параметров сократительной активности миокарда после тотальной нормотермической 30-минутной ишемии с последующей 30-минутной реперфузией.

В ранее проведённых исследованиях по оценке сократительной активности мышечных объектов установлено, что наиболее информативными регистрируемыми показателями изолированного сердца являются давление перфузии, давление в левом желудочке (систолическое, диастолическое), частота сердечных сокращений (ЧСС), а также расчётные показатели – интегральный показатель сократимости сердца за 1 мин (Int_мин) и первая производная давления по времени (+dP/dt), характеризующая скорость развития сокращения миокарда [8].

Для сегментов изолированных лимфатических сосудов регистрировали частоту и амплитуду фазных сокращений, а эффективность сократительной функции оценивали с использованием расчётного показателя – минутной производительности, определяемой как площадь под кривой миограммы сокращений сегментов лимфатических сосудов [9, 10]. При анализе результатов оценивали динамику параметров сократительной активности сердца и сегментов лимфатических сосудов по сравнению со значениями в контрольной группе животных. Статистическую обработку результатов исследования проводили в программе GraphPad Prism 5.04. Для выявления значимости различий показателей в динамике применяли Т-критерий Вилкоксона для связанных выборок, для выявления межгрупповых парных различий – U-критерий Манна – Уитни. Статистически значимыми считались различия при р ≤ 0,05.

Результаты

При анализе влияния ксенобиотиков на сердце определяют площадь под кривой сокращений левого желудочка – ключевой интегральный показатель, отражающий работу миокарда и позволяющий оценить нагнетательную функцию сердца. Этот параметр позволяет учитывать не только геометрию желудочка, но и энергетические затраты на изгнание крови, что особенно важно при диагностике ранних стадий дисфункции. Поскольку влияние ксенобиотиков на сердце может быть реализовано через разнонаправленные хронотропный и инотропный эффекты, при анализе конечного кардитропного эффекта целесообразно использование интегрального показателя сократимости сердца.

В ходе субхронического эксперимента по оценке кардиовазотропного влияния нитритна натрия и НДМГ на изолированном сердце крысы показано статистически значимое снижение интегрального показателя сократимости миокарда во всех опытных группах (рис. 1).

В экспериментах на изолированных сегментах лимфатических сосудов крыс, подвергнутых субхроническому воздействию нитрита натрия и НДМГ, также выявлено снижение минутной производительности при всех исследуемых концентрациях ксенобиотиков (рис. 2). Полученные сходные результаты влияния изучаемых ксенобиотиков на изолированные органы связаны, вероятно, с аналогичными механизмами их действия на изучаемые мышечные органы.

Регистрация скорости развития сократительной функции миокарда выявила снижение данного показателя во всех исследуемых группах. Результаты приведены на рис. 3.

Снижение интегрального показателя сократимости сердца обусловлено угнетающим воздействием нитрита натрия и НДМГ на энергетический метаболизм миокарда в результате нарушения синтеза АТФ, транспорта ионов Ca²⁺, усиления перекисного окисления липидов и, как следствие, ухудшения электромеханического сопряжения и сокращения миокарда. О нарушении энергетического баланса сердца, вызванного субхроническим влиянием нитрита натрия и НДМГ, свидетельствует снижение максимальной скорости сокращения левого желудочка.

Для объективной токсикологической характеристики исследуемых ксенобиотиков необходимо определить, является ли их негативное влияние на сократимость органов первичным, вследствие нарушения энергетического метаболизма, либо вторичным – через воздействие на электрическую активность.

В результате анализа электрической активности изолированного сердца и сегментов лимфатических сосудов экспериментальных животных, получавших нитрит натрия в течение 28 дней, статистически значимых изменений частоты сердечных сокращений и частоты фазных сокращений лимфатических сосудов не выявлено. Можно предположить, что нитрит натрия при субхроническом введении оказывает непосредственное угнетающее действие на сократимость, вероятно, вследствие нарушения энергетического метаболизма.

Субхроническое введение животных НДМГ вызывает статистически значимое угнетение ЧСС изолированного сердца и частоты фазных сокращений сегментов лимфатических сосудов крысы в дозах 0,2 и 2 мг/кг м.т. (рис. 4). Поскольку частота сокращений характеризует процессы возбуждения, происходящие в клетках водителя ритма, можно предположить, что НДМГ в средней и большой дозах приводит к снижению пейсмекерной активности сердца и лимфангионов, вероятнее всего, за счёт гиперполяризации мембраны.

При анализе влияния субхронического применения нитрита натрия и НДМГ установлено выраженное расслабляющее действие в отношении коронарного русла сердца (рис. 5).

Одним из наиболее репрезентативных исследований, проводимых при оценке функционального состояния изолированного сердца в токсикологических и фармакологических исследованиях, является нагрузочный ишемический тест с последующей реперфузией. Это эффективный инструмент для выявления ранних доклинических нарушений сердечной функции, вызванных токсическими агентами, который позволяет прогнозировать риск развития осложнений при ишемической болезни сердца на фоне химической нагрузки.

В субхроническом эксперименте с нитритом натрия во время реперфузии степень восстановления функциональных параметров изолированного сердца имела дозозависимый характер. В группе животных, получавших наибольшую дозу нитрита натрия, наблюдалось наиболее полное восстановление интегрального показателя сократимости (рис. 6), чем в контроле (т.е. нитрит натрия в дозе 2,8 мг/кг м.т. обладает противоишемическим действием). Меньшие дозы нитрита натрия 0,028 и 0,28 мг/кг м.т., снижают устойчивость миокарда к ишемии-реперфузии.

Субхроническое введение НДМГ животным в дозе 2 мг/кг м.т. статистически значимо угнетает восстановление интегрального показателя сократимости изолированного сердца в условиях проведения теста «ишемия-реперфузия» (см. рис. 6). В дозе 0,2 мг/кг м.т. НДМГ, существенно не влияя на конечную степень восстановления, лишь несколько снижает скорость восстановления указанного показателя.

Обсуждение

В токсикологических исследованиях система кровообращения выступает как критическая мишень для ксенобиотиков, будучи чрезвычайно уязвимой к токсическим воздействиям, которые могут проявляться нарушением ритма, сократимости, тонуса сосудов и целостности эндотелия. С другой стороны, сохранность функции сердечно-сосудистой системы определяет фармакокинетику ксенобиотиков и выполняет их доставку к органам-мишеням. Любое нарушение функций системы кровообращения быстро отражается на перфузии всех органов, опосредуя и усугубляя их вторичное повреждение. Таким образом, оценка кардиоваскулярных эффектов – необходимый компонент комплексной токсикологической оценки ксенобиотиков, дающий понимание не только прямого кардиотоксического потенциала, но и косвенного влияния токсиканта на системный гомеостаз. Высокую информативность показало использование тест-системы на основе изучения параметров изолированного сердца и сегментов лимфатических сосудов экспериментальных животных. Особенностью модели изолированного сердца по Лангендорфу является ретроградная подача перфузата в сердце через аорту, что значительно упрощает подготовку препарата по сравнению с классической моделью изолированного сердца. В целом это информативный, доступный и достаточно широко распространённый метод доклинического изучения фармакологических препаратов, который позволяет с высокой точностью детектировать начальные функциональные сдвиги, индуцированные токсикантом: от изменений коронарного кровотока и аритмогенности до нарушений вазореактивности. Важную роль в тест-системе играют изолированные сегменты сосудистого русла, в том числе лимфатических сосудов, обладающие хорошо выраженной фазной активностью, близкой по своим характеристикам к сократительной активности сердца (автоматия, цикл «систола – диастола») и вен (сократимость, ёмкостная функция), что делает данную модель уникальной для оценки кардио- и вазотоксического действия ксенобиотиков.

В качестве модельных препаратов, на которых проводилась оценка возможности применения тест-системы для выявления ранних признаков функциональных нарушений, выбраны НДМГ в качестве промышленного токсиканта и нитрит натрия, представляющий собой пищевую добавку, широко используемую при производстве мясных продуктов глубокой переработки.

В ходе анализа полученных результатов выявлено угнетающее действие НДМГ и нитрита натрия во всех исследуемых дозах на интегральный показатель сократимости изолированного сердца и показатель минутной производительности сегментов лимфатических сосудов крысы. НДМГ, кроме снижения силы сокращений, обладает отрицательным хронотропным действием. То есть, в результате влияния гептила, происходит нарушение электрофизиологии и биомеханики сердца. При действии НДМГ на лимфатические сосуды наблюдается снижение всех параметров спонтанной активности, что может говорить о нарушении в гладкомышечных клетках как сократительных, так и электрических процессов. Как следствие, происходит угнетение насосной функции лимфангионов. Нитрит натрия вызывает развитие отрицательного инотропного действия, практически не влияя на частоту сокращения сердца и сегментов лимфатических сосудов.

В литературе имеются данные об изучении взаимосвязи нитритов, поступающих с пищей, водой или в составе пищевых добавок, с риском развития болезней системы кровообращения в крупной популяционной когорте (106288 человек). Было обнаружено, что участники с более высоким потреблением нитритов из пищевых добавок (в частности, нитрита натрия E250) имеют более высокий риск развития гипертонии по сравнению с теми, кто их не употреблял [11]. Однако, в представленном исследовании нитрит натрия при субхроническом применении вызывал выраженную дилатацию коронарного русла сердца крыс. Полученный результат высокого риска развития гипертонии, вероятно, объясняется комплексным влиянием других, не учтённых в исследовании привычек в питании или образе жизни участников. Часто в продуктах, содержащих нитрит натрия много дополнительных компонентов, таких как поваренная соль, насыщенные жиры и холестерин, которые потенциально могут приводить к развитию гипертонии. В нашем же исследовании представлены результаты влияния нитрита натрия в моноварианте на изолированное сердце. В ряде исследований на животных в рамках экспериментальных моделей остановки сердца, инфаркта миокарда именно NO-зависимой дилатацией коронарного русла и улучшением мирососудистой перфузии объясняется потенциал нитрита в качестве терапии во время реанимации [12, 13]. На крысах показано, что однократная низкая доза нитрита натрия (0,13 мг/кг м.т.), введённая внутривенно во время реанимации, значительно улучшила выживаемость (19 из 25,76% против 12 из 25,48 %, p = 0,033) [14]. В собственном исследовании после субхронического введения животным нитрита натрия в ишемическом тесте на модели изолированного сердца во время реперфузии степень восстановления функциональных параметров сердца была прямо пропорциональна исследуемой дозе. В группе животных, получавших наибольшую дозу нитрита натрия – 2,8 мг/кг м.т., наблюдалось наиболее полное восстановление интегрального показателя сократимости. В меньших изучаемых дозах (0,028 и 0,28 мг/кг м.т.) нитрит натрия при субхроническом введении снижал устойчивость миокарда к ишемии-реперфузии. Защитное действие нитрита натрия в дозе 2,8 мг/кг м.т. может быть объяснено феноменом ишемического прекондиционирования в результате формирования гипоксической устойчивости миокарда, вызванной образованием метгемоглобина под влиянием высоких доз нитрита натрия [15].

Ещё один механизм цитопротекторного действия нитрита при реперфузии, по данным некоторых авторов, может заключаться в подавлении митохондриального дыхания и снижении уровня активных форм кислорода [16, 17]. Показано, что нитрит дозозависимо вызывает S‑нитрозилирование и ингибирует митохондриальный комплекс I в моделях ишемии‑реперфузии. Эта посттрансляционная модификация снижает перенос электронов через комплекс I, что эффективно уменьшает выработку АФК при реперфузии и предотвращает окисление белков и потерю их функции [18].

Ограничения исследования. Результаты получены в экспериментальной модели при субхроническом введении в течение 28 дней только на самцах белых крыс, оценка проводилась в одной временной точке, отсутствует гистологическая и биохимическая верификация выявленных нарушений.

Заключение

Таким образом, комбинированное применение ex vivo моделей изолированного сердца и лимфатических сосудов позволило выявить ранние признаки функциональных нарушений при субхроническом применении нитрита натрия начиная с дозы 0,028 мг/кг м.т. (0,004 мг/кг м.т. – расчётная доза для человека), что значительно меньше установленного ВОЗ допустимого суточного потребления – 0,07 мг/кг м.т. для человека. Также с помощью изучаемой тест-системы установлено кардиовазотропное действие НДМГ во всех исследуемых дозах начиная с 0,02 мг/кг м.т., что на порядок ниже дозы 0,2 мг/кг м.т., при которой токсические эффекты НДМГ выявляются методами in vivo.

Применение тест-системы на основе изолированного сердца и сегментов лимфатических сосудов позволяет получить не только количественную характеристику кардиотоксического действия ксенобиотика, но и выявить его таргетные мишени, а также изучить возможные механизмы действия ксенобиотиков и подобрать эффективные средства фармакологической коррекции. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование экспериментальных методов ex vivo – высокоинформативный метод исследования, который, несомненно, должен найти применение при оценке токсичности ксенобиотиков.