Нефротоксический эффект кадмия и способы коррекции с использованием экстракта иван-чая узколистного

Введение

Загрязнение окружающей среды провоцирует рост заболеваемости и смертности во всем мире и обоснованно привлекает повышенное внимание общественного здравоохранения [1, 2]. Попадая в организм, экополлютанты могут оказывать действие на различные органы-мишени, при этом почки особенно уязвимы для действия загрязнителей, поскольку в процессе метаболизма большинство токсинов концентрируется в почках в процессе фильтрации [3]. Продолжительное воздействие низких доз токсикантов в повседневной жизни приводит к развитию патофизиологических изменений, хроническому системному воспалению и окислительному стрессу, что способствует развитию почечной недостаточности [4, 5]. Велика роль тяжёлых металлов как распространённых загрязнителей окружающей среды [6]. В частности, кадмий (Cd) активно поступает во внешнюю среду, будучи побочным продуктом производства аккумуляторов, лакокрасочных материалов, добычи руд, сжигания топлива и применения удобрений [7]. Попадая в организм, кадмий оказывает прямое повреждающее действие на структуру митохондрий, усиливает выработку активных форм кислорода (АФК), что приводит к дисбалансу и развитию окислительного стресса [8]. Механизм окислительного повреждения становится основной причиной повреждения структур и нарушения работы почек, что впоследствии осложняется влиянием Cd на регуляцию генов, процессы синтеза белков и работу ферментных систем и приводит к развитию хронической почечной недостаточности, поскольку почки являются основной мишенью токсического действия кадмия [5, 8].

Растительные полифенолы способны снижать последствия токсического действия тяжёлых металлов [9, 10]. Иван-чай узколистный (Chamaenerion angustifolium (L.) Scop., семейство Onagraceae) – доступный источник полифенолов; основным его компонентом является элаготанин энотеин В (содержание достигает 20–35%), который проявляет нефропротекторные свойства за счёт высокой антиоксидантной активности, а также вспомогательного противовоспалительного и антипролиферативного действия [11, 12].

Цель исследования – оценить влияние субхронической интоксикации кадмием на биохимические показатели повреждения почек, способность организма к самостоятельному восстановлению в постинтоксикационный период и возможность коррекции нарушений экстрактом иван-чая узколистного с применением различных методических подходов.

Материал и методы

 Исследование выполнено на базе экспериментально-биологической клиники Курского государственного медицинского университета. Животные содержались в условиях вивария на стандартном пищевом рационе в осенне-зимний период с соблюдением 12-часового режима «день – ночь». Все исследования проводились с учётом положений Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123), директивой Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/EC от 22.09.2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей.

Эксперимент проводился на 150 самцах крыс стока Вистар с исходной массой тела (м.т.) 220–230 г, которые были рандомно разделены на 15 групп по 10 особей в каждой. Критериями исключения животных в начале экспериментального исследования было отклонение более ±10% массы тела от среднего значения, наличие клинических признаков болезни; в ходе эксперимента – спонтанная гибель животного до окончания воздействия, отказ от потребления питьевого раствора (потребление менее 70% суточного объёма), выраженные клинические признаки дистресса.

Крыс групп Контроль (7, 14, 21, 28, 56 суток) содержали на стандартном рационе, который состоял из чистой питьевой воды и комбикорма ЛБК-120-10-2023 («Белгородские корма», Россия). Крыс групп Кадмий (7, 14, 21, 28 суток) поили водным раствором кадмия ацетата (ЧДА 99,5%, ОРТ «Химреактивы», Россия) с концентрацией 0,096 г/л в сутки, доза кадмия ацетата 1/50 LD₅₀ (LD₅₀ = 360 мг/кг м.т.)*, что соответствует 7,2 мг/кг/сутки, исходя из объёма потребляемой жидкости 20 мл/сутки. Для крыс группы Стандартный рацион 56 суток после 28 дней интоксикации поступление кадмия прекращалось, крысы переводились на стандартный рацион в течение последующих 28 дней до момента выведения из эксперимента.

Для коррекции использовали экстракт иван-чая узколистного, обогащённый энотеином В. Экстракт получали по разработанной авторской методике (патент № 2853345) [13]. В качестве сырья использовали листья иван-чая узколистного. Сырье заготавливали в период цветения, собирали в окрестностях Курска (деревня Шуклинка), высушивали, измельчали до размера частиц не более 5 мм. Подготовленное сырье экстрагировали в аппарате Сокслета водно-спиртовой смесью с содержанием спирта этилового 30% до полного истощения сырья, полученный экстракт очищали в делительной воронке органическими растворителями (петролейный эфир, диэтиловый эфир, этилацетат), очищенное извлечение упаривали и дополнительно очищали посредством колоночной хроматографии, элюировали смесью воды очищенной с этиловым спиртом (100 : 1) и в фракциях 5–7 получали экстракт дубильных веществ иван-чая узколистного с повышенным содержанием энотеина В. Количественное содержание энотеина В определяли спектрофотометрически по разработанной методике (патент РФ № 2842367) [14]. В полученном экстракте концентрация энотеина В составила 236,95 ± 25,36 мг/мл.

В группах Коррекция 7, 14, 21, 28 суток крысы перорально получали одновременно раствор кадмия ацетата и экстракт иван-чая, обогащённый энотеином В, в котором доза энотеина В, необходимая для профилактики оксидативного стресса, составляла 1,29 мг на одно лабораторное животное массой 200 г (6,45 мг/кг м.т.). Расчёт дозы проводили по методике определения биоэквивалентности веществ с антиоксидантной активностью (патент № 2836339) [15]. Для крыс группы Коррекция 56 суток после 28 дней интоксикации поступление кадмия прекращалось, проводилась коррекция в течение 28 суток экстрактом иван-чая, обогащённым энотеином В.

Выводили животных из эксперимента путём декапитации под эфирным наркозом, забор крови производили из правого желудочка сердца. Кровь центрифугировали в течение 15 мин при 10000 g (Eppendorf Minispin, Германия) для получения плазмы, в которой оценивали биохимические показатели повреждения почек по содержанию креатинина, мочевины и мочевой кислоты.

Для определения креатинина использовали набор «КРЕАТИНИН-UTS» (ООО «ЭЙЛИТОН», Россия). Концентрацию креатинина определяли по методу Яффе при длине волны 510 нм. Определение концентрации мочевины проводили ферментативным кинетическим методом с использованием набора реагентов «КлиниТест-Мочевина» (НПЦ «ЭКО-СЕРВИС», Россия) при длине волны 340 нм. Для определения мочевой кислоты использовали набор реагентов «Мочевая кислота АБРИС+» (НПФ «АБРИС+», Россия). Определение проводили фотометрически по уриказному методу при длине волны 500 нм. Все измерения выполняли на спектрофотометре BioRad SmartSpec Plus, США.

Для статистического анализа использовали программу Statistica 13.0 (StatSoft, США). Гипотезу о нормальном распределении количественных показателей проверяли с помощью критерия Шапиро – Уилка. Поскольку большинство данных не подчинялось нормальному распределению, количественные показатели представлены в виде медианы и значений нижнего и верхнего квартилей (Me [0,25–0,75]). Для степени различий между группами использовали непараметрический критерий Краскела – Уоллиса, затем рассчитывали р-значения с помощью критерия Манна – Уитни с поправкой Бонферрони. Полученные значения критерия Краскела – Уоллиса, которые превышали критические, считали статистически значимыми (p < 0,05). Для создания графического материала использовали пакет программ Excel (MS Office, США).

Результаты

 Поступление кадмия ацетата в дозе 1/50 LD₅₀ в течение 28 дней приводило к статистически значимым изменениям биохимических показателей повреждения почек.

При сравнении групп интоксикации между собой установлено, что значимое повышение содержания креатинина происходило на 21-е сутки эксперимента при сравнении с группой Кадмий 7 суток и 14 суток (p = 0,0016) (рис. 1). На 28-е сутки повышение продолжалось, изменения значимы в сравнении с группой Кадмий 7 суток (p < 0,0001). В сравнении с группой Контроль 7 суток уровень креатинина повышался уже на 7-е сутки эксперимента (рис. 2). Стабильное увеличение показателя наблюдалось на протяжении всего эксперимента, достигая наибольшего варьирования на 21-е сутки интоксикации (интерквартильный размах IQR = 5,57–13,99). Поступление препарата коррекции совместно с кадмием заметно замедляло повышение уровня креатинина (интерквартильный размах IQR = 4,93–9,76) с наибольшим варьированием также на 21-е сутки, и, хотя увеличение наблюдалось, на 28-е сутки оно становилось незначимым в сравнении с группой Контроль 28 суток, а варьирование наименьшим. Снижение креатинина в группе коррекции в сравнении с группой кадмия также достигало наибольшей значимости на 28-е сутки (p = 0,0247).

Сравнение групп интоксикации позволило установить, что значимое возрастание концентрации мочевой кислоты на 14-е (p = 0,0295), 21-е и 28-е сутки (p < 0,0001) экспозиции кадмием наблюдается в сравнении с группой Кадмий 7 суток, после 14 суток увеличение незначимо в группе Кадмий (см. рис. 1). В сравнении с контролем статистически значимое увеличение содержания мочевой кислоты наблюдалось на 7-е сутки поступления кадмия (p = 0,0007) (рис. 3). При этом наибольшее варьирование отмечалось на 21-е сутки (интерквартильный размах IQR = 19,93–29,83), а содержание – на 28-е сутки (177,74 мкмоль/л). Использование экстракта иван-чая, обогащённого энотеином В, позволяло добиться статистически значимого снижения содержания мочевой кислоты уже на 14-е сутки в сравнении с группой Кадмий 14 суток (p = 0,0332). Хотя уровень мочевой кислоты в группе коррекции не достигал контроля, различия становились статистически незначимыми уже на 21-е сутки в сравнении с соответствующей группой контроля.

В течение эксперимента в группах интоксикации содержание мочевины заметно варьировало (интерквартильный размах IQR = 0,82–1,93). Статистически значимое увеличение уровня мочевины в группе интоксикации наблюдается на 21-е сутки в сравнении с группой Кадмий 7 суток (p = 0,0060) (см. рис. 1). На 28-е сутки рост стал значимым и в сравнении с группой Кадмий 14 суток (p = 0,0029). Повышение концентрации мочевины в сравнении с группой контроля отмечалось с 7-х суток интоксикации и оставалось значимым в течение периода интоксикации (p < 0,0001) (рис. 4). В группе коррекции в сравнении с контролем значимое увеличение мочевины наблюдалось лишь на 21-е (p = 0,0229) и 28-е сутки (p = 0,0332). При этом на фоне группы интоксикации концентрация мочевины при приёме препарата коррекции оставалась значимо ниже на 7-е (p = 0,0144), 14-е (p = 0,0028) и 28-е (p = 0, 0332) сутки.

Отдельным аспектом исследования было изучение способности организма к восстановлению за счёт собственных адаптивных ресурсов и возможности коррекции нарушений, возникших при субхронической интоксикации, экстрактом иван-чая узколистного, обогащённого энотеином В, в течение 28 суток после прекращения поступления токсиканта, а также сравнение эффективности двух подходов к коррекции.

Снижение уровня креатинина в группе Стандартный рацион 56 суток на фоне группы Кадмий 28 суток было незначимым, на фоне группы Контроль 56 суток повышение остаётся значимым (p < 0,0001) (рис. 5). В группе Коррекция 28 суток наблюдалось значимое снижение уровня креатинина на фоне группы Интоксикация 28 суток (p < 0,0247). Статистически значимых различий между группами Коррекция 28 суток и Коррекция 56 суток не установлено.

Содержание мочевой кислоты после прекращения поступления кадмия в группе Стандартный рацион было сопоставимо с группой Кадмий 28 суток и превышало значение контроля в 1,6 раза (рис. 6). Применение коррекции в обоих вариантах способствовало значимому снижению уровня мочевой кислоты как на фоне интоксикации в течение 28 суток (p = 0,0011), так и на фоне применения стандартного рациона (p = 0,0034). Различия между группами Коррекция 28 суток и Коррекция 56 суток значимы.

При переводе на стандартный рацион сохранялся повышенный уровень мочевины, при этом наблюдали максимальные значения за весь период интоксикации (14,35 ммоль/л; интерквартильный размах IQR = 2,71) (рис. 7). Поступление препарата коррекции в обоих вариантах значимо снижало уровень мочевины в сравнении с группой Кадмий 28 суток (p = 0,0156) и группой Стандартный рацион (p < 0,0332). На фоне контроля уровень мочевины оставался значимо высоким в группе Коррекция 56 суток. Значимые различия между двумя группами коррекции не были достигнуты.

Обсуждение

Полученные результаты подтверждают, что на протяжении всего периода исследования ацетат кадмия оказывает влияние на биохимические показатели повреждения почек. Известно, что в клетке Cd нарушает работу митохондрий, следствием чего становится повышенная продукция активных форм кислорода [16]. АФК вовлекают в процессы окисления молекулы ненасыщенных жиров, превращая их в свободные радикалы, концентрация которых быстро повышается [5, 8]. Кадмий, наряду с основным повреждающим механизмом окисления, на начальных этапах синтеза белка связывается с активными центрами молекул и реакционноспособными группами, нарушает фолдинг белка. Синтез ферментов антиоксидантной системы снижается, а несвернутые белки накапливаются в клетке [17]. Нарушение прооксидантно-антиоксидантного баланса клетки и белкового обмена приводит к сбою естественных процессов аутофагии повреждённых клеток, следствием чего становятся пролиферация, воспаление и апоптоз клеток, проявляющийся в нарушении работы почек [18]. О повреждении почек судят по таким биохимическим показателям, как уровень креатинина, мочевой кислоты и мочевины, поскольку повышенный уровень этих показателей в плазме свидетельствует о нарушении фильтрующей способности почек вследствие повреждения и воспаления [19]. По концентрации мочевины судят о балансе между скоростью её синтеза и выведения почками, а повышение продукции мочевины наблюдается при нарушении белкового обмена [20, 21]. В нашем исследовании наибольшая выраженность изменений наблюдается на 21-е и 28-е сутки интоксикации, что выражалось в стабильно высоком уровне креатинина, мочевой кислоты, мочевины. Данные показатели указывают не только на состояние почек, но и на негативное действие Cd на белковый обмен. Наблюдаемые при субхронической интоксикации кадмием тенденции согласуются с литературными данными, как и количественный диапазон показателей [20].

Установлено, что после прекращения поступления кадмия в организм признаки полного восстановления биохимических показателей работы почек отсутствуют, что позволяет судить о выраженном нефротоксическом эффекте и невозможности восстановления организма за счёт собственных ресурсов адаптации.

Растительные полифенолы проявляют нефропротекторные свойства и демонстрируют положительный эффект при совместном поступлении с токсикантами [9, 10]. Энотеин В относится к антиоксидантным соединениям группы эллаготанинов, выступает ловушкой свободных радикалов и хелатором ионов кадмия, помогая нивелировать его токсическое действие [12].

В результате исследования впервые установлено, что экстракт иван-чая узколистного, обогащённый энотеином В, при интоксикации кадмия ацетатом значительно стабилизирует уровень биохимических показателей повреждения почек. Отмечено снижение концентрации креатинина, мочевой кислоты и мочевины в плазме. При этом не установлено значимых различий между вариантами приёма препарата коррекции, кроме показателя мочевой кислоты.

Таким образом, полученные данные указывают на выраженные нефропротекторные свойства экстракта иван-чая узколистного, обогащённого энотеином В, в связи с чем препарат может быть рассмотрен в качестве перспективного средства коррекции при кадмиевой интоксикации.

Результаты проведённой работы вносят вклад в представление о повреждающем действии кадмия на почки и возможностях коррекции развития патологических процессов. Дальнейшие исследования с гистологическим изучением почек, определением показателей оксидативного стресса, воспаления, распределения кадмия в тканях позволят уточнить механизмы нефротоксического эффекта кадмия.

Ограничения исследования связаны с особенностями дизайна: использованием самцов крыс и плазмы в качестве объекта, отсутствием гистологических исследований для анализа морфологических изменений в тканях почек.

Заключение

На протяжении всего эксперимента установлено влияние субхронической интоксикации кадмием на биохимические показатели повреждения почек. При этом показано, что в течение 28 суток после прекращения интоксикации организм не способен к самостоятельному восстановлению биохимического гомеостаза. Применение экстракта иван-чая узколистного, обогащённого энотеином В, оказывает положительное влияние на состояние почек и белковый обмен. Применение препарата коррекции эффективно как в процессе интоксикации, так и в постинтоксикационный период.

* Cadmium acetate: Safety Data Sheet CXCD010. [Internet]. Gelest Inc. 2025. URL: https://www.gelest.com/wp-content/uploads/CXCD010_CADMIUM-ACETATE-dihydrate_GHS-US_English-US.pdf [cited 2026 march 17]