Разработка и валидация методики количественного определения ротенона в гомогенате коры головного мозга крыс методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Введение. Ротенон — нейротоксин, вызывающий повреждение дофаминергических нейронов чёрной субстанции и используемый в качестве средства для моделирования экспериментального паркинсонического синдрома. Разработка методики количественного определения ротенона в головном мозге позволит предложить и апробировать новые стратегии фармакотерапии паркинсонизма, связанные со снижением проникновения нейротоксических веществ в мозг.

Цель исследования заключалась в разработке и валидации ВЭЖХ-методики (высокоэффективная жидкостная хроматография) количественного определения ротенона в коре больших полушарий головного мозга крыс.

Материал и методы. Количественное определение ротенона осуществляли с помощью хроматографической системы Stayer («Аквилон», Россия) с УФ-спектрофотометрическим детектором UVV 104 при длине волны 296 нм в изократическом режиме. Применяли обращенно-фазную хроматографическую колонку Luna C18 100Å (250*4,6) с зернением 5 мкм при температуре 37°С. Состав подвижной фазы: вода деионизированная, ацетонитрил в соотношении 70:30. Определение концентрации ротенона проводили методом абсолютной калибровки по площади пиков.

Пробоподготовка заключалась в гомогенизации 500 мг измельченной лобной доли коры головного мозга крыс в 500 мкл воды очищенной с последующим центрифугированием (1750 g), отбором надосадочной жидкости, осаждением белка ацетонитрилом (2,5 мл). Водный слой упаривали на роторно-вакуумном испарителе. К сухому остатку добавляли 250 мкл подвижной фазы и 100 мкл инжектировали в хроматограф.

Результаты. Методика была валидирована по следующим параметрам: селективность, линейность, точность, прецизионность, пределы обнаружения и определения, перенос пробы, стабильность образцов. Аналитический диапазон составил 62,5−1000,0 нг/г мозга с коэффициентом корреляции более 0,99. Предел обнаружения и количественного определения ротенона составляли соответственно 25,0 и 62,5 нг/г. Расчет внутри- и межцикловой точности и прецизионности показал, что данные параметры не превышают 20% для концентрации, соответствующей нижнему пределу количественного определения, и 15% — для более высоких концентраций. Стабильность методики продемонстрирована при краткосрочном хранении в условиях комнатной температуры, трехкратном цикле заморозки-разморозки при минус 80°С, хранении при минус 80°С в течение 60 сут. Перенос пробы отсутствовал.

Ограничения исследования. Разработанная хроматографическая методика позволяет анализировать содержание ротенона в коре головного мозга крыс в диапазоне концентраций 62,5−1000,0 нг/г.

Заключение. Разработана и валидирована методика количественного определения ротенона в гомогенате коры больших полушарий головного мозга крыс.

Соблюдение этических стандартов. Экспериментальное исследование было одобрено комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.

Участие авторов:
Градинарь М.М. — выполнение хроматографических исследований, пробоподготовка;
Щулькин А.В. — статистическая обработка результатов, написание текста;
Черных И.В. — выполнение хроматографических исследо-ваний, расчёт валидационных параметров;
Якушева Е.Н. — руководство исследованием, написание текста.
Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. 

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Поступила в редакцию: 08 июня 2023 / Принята в печать: 02 февраля 2023 / Опубликована: 30 апреля 2023 

1. Sherer T.B., Betarbet R., Testa C.M., Seo B.B., Richardson J.R., Kim J.H., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson’s disease. Journal of Neuroscience. 2003; 23(34): 10756–64. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.23-34-10756.2003

2. Watabe M., Nakaki T. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone inhibits and redistributes vesicular monoamine transporter 2 via nitration in human dopaminergic SH-SY5Y cells. Molecular Pharmacology. 2008; 74: 933–40. https://doi.org/10.1124/mol.108.048546

3. Alam M., Schmidt W.J. l-DOPA reverses the hypokinetic behavior and rigidity in rotenone-treated rats. Behavioural Brain Research. 2004; 153: 439–46. https://doi.org/10.1016/j.bbr.2003.12.021

4. Betarbet R., Sherer T.В., Greenamyre J.T. Animal models of Parkinson Disease. Bioessays. 2002; 24(4): 308–18. https://doi.org/10.1002/bies.10067

5. De Miranda B.R., Fazzari M., Rocha E.M., Castro S., Greenamyre J.T. Sex differences in rotenone sensitivity reflect the male-to-female ratio in human Parkinson’s disease incidence. Toxicol Sci. 2019; 170(1): 133−43. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfz082

6. Caboni P., Sarais G., Vargiu S., Luca M.A., Garau V.L., Ibba A., Cabras P. LC–MS–MS Determination of Rotenone, Deguelin, and Rotenolone in Human Serum. Chromatographia. 2008; 68: 739−45. https://doi.org/10.1365/s10337-008-0830-0

7. Di Donna L., Grassi G., Mazzotti F., Perri E., Sindona G. High-throughput assay of rotenone in olive oil using atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 2004; 39(12): 1437−40. https://doi.org/10.1002/jms.694

8. Taylor M.J., Keenan G.A., Reid K.B., Fernandez D.U. The utility of ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionisation time-of-flight mass spectrometry for multi-residue determination of pesticides in strawberry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2008; 22(17): 2731−46. https://doi.org/10.1002/rcm.3671

9. Huang J., Liu H., Gu W., Yan Z., Xu Z., Yang Y., et al. A delivery strategy for rotenone microspheres in an animal model of Parkinson’s disease. Biomaterials. 2006; 27: 937−46. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2005.07.005

10. Черных И.В, Щулькин А.В., Мыльников П.Ю., Гацанога М.В., Есенина А.С., Градинарь М.М., Якушева Е.Н. Функциональная активность гликопротеина-P в гематоэнцефалическом барьере на фоне экспериментального паркинсонического синдрома. Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2019; 27(2): 150−9. https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2019272150-159

11. Мыльников П.Ю., Черных И.В., Щулькин А.В., Попова Н.М., Якушева Е.Н. ВЭЖХ-методика количественного анализа фексофенадина в печени кроликов. Фармация и фармакология. 2020; 8(1): 40–7. https://doi.org/10.19163/2307-9266-2020-8-1-40-47