Токсическое действие медицинских изделий в тест-моделях in vitro и in vivo

Введение

Использование последних достижений науки и технологий путём внедрения в клиническую практику новых изделий медицинского назначения способствует решению актуальных задач здравоохранения [1–8]. Новые медицинские изделия при постановке на производство и дальнейшей реализации должны сохранять свои функциональные свойства и соответствовать требованиям безопасности в течение всего предполагаемого срока годности. Применение изделий медицинского назначения с неправильно установленным сроком годности может снижать эффективность оказания медицинской помощи, вызывать осложнения и приводить к инвалидизации пациентов [9–13].

При регистрации новых медицинских изделий изготовители используют различные условия «ускоренного старения» для быстрого установления сроков годности¹^,². По окончании моделирования старения производители изучают только технические характеристики изделий и не оценивают их потенциальные токсические свойства – важную составляющую гигиенической безопасности медицинских изделий [14–18]. Метод определения сроков годности медицинских изделий в настоящее время отсутствует.

Для научного обоснования методических подходов к ускоренному установлению сроков годности новых изделий медицинского назначения определяют их токсические свойства после пребывания в условиях «ускоренного старения», используя лабораторных животных и альтернативные тест-модели.

Цель исследования – изучить токсическое действие медицинских изделий, имеющих различную продолжительность и способ контакта с пациентами, в тест-моделях in vitro и in vivo после пребывания в условиях «ускоренного старения».

Материал и методы

 Для оценки токсичности изделий медицинского назначения после «ускоренного старения» были отобраны одноразовые стерильные изделия, имеющие однократный кратковременный (n = 28), длительный или постоянный (n = 22) контакт с внутренней средой пациентов, и нестерильные изделия, имеющие кратковременный (n = 21) контакт с поверхностью тела пациентов. Исследовали медицинские изделия производства следующих стран: США, Республика Беларусь, Индия, Малайзия, Российская Федерация, Китай, Дания, Турция, Германия, Великобритания, Коста-Рика, Бельгия и Пуэрто-Рико. Заявленный изготовителем срок годности изделий составлял 5 лет. В начале эксперимента (этап «ускоренного старения») период хранения изделий с даты производства составлял до 30 дней.

Условия «ускоренного старения» моделировали путём термостатирования медицинских изделий в универсальном сушильном шкафу. Опытные группы изделий подвергали «ускоренному старению» при температуре плюс 80–95 °C в течение 18,7 суток при моделировании срока хранения 5 лет, 11,2 суток – при моделировании срока 3 года, 3,7 суток – 1 год. Температура для «ускоренного старения» изделий на 50 °С превышала заявленный производителем показатель. Длительность была рассчитана по формуле, описанной в стандарте ASTM F1980–21³. Медицинские изделия группы сравнения не подвергали старению, а хранили соответствующее время в рекомендованных производителем условиях.

Для каждого медицинского изделия после пребывания в условиях «ускоренного старения» имитировали его клиническое применение. Готовили вытяжки из изделий в 0,9%-й раствор натрия хлорида при температуре плюс 37 °С в зависимости от площади поверхности или массы медицинского изделия к объёму модельной среды и времени контакта медицинского изделия с организмом человека⁴.

Затем оценивали токсические свойства вытяжек из контрольных и опытных изделий. Для этого использовали 201 нелинейную белую мышь массой тела 18–22 г, 212 рандомбредных белых крыс массой тела 180–250 г и 19 кроликов породы шиншилла массой тела 2,0–3,5 кг. Животных содержали в условиях, соответствующих установленным требованиям, и после 14-дневного карантина использовали повторно.

Сенсибилизирующее действие медицинских изделий изучали в тест-модели опухания лапы мыши (ТОЛМ). Оценка осуществлялась по толщине лапы мыши после введения внутрикожно вытяжек из изделий и величине отёка. Изучение пирогенных реакций проводили путём анализа изменения температуры тела кроликов после внутривенной инъекции стерильной вытяжки из изделий в ушную вену. Для расчёта использовали максимальные значения повышения температуры каждого лабораторного животного. Оценку совместимости с кровью медицинских изделий в опытных и контрольной группах проводили с помощью гемолитической тест-модели in vitro, основанной на изменении уровней гемолиза эритроцитарной взвеси венозной крови крыс. Исследование цитотоксических свойств вытяжек из изделий осуществляли в МТТ-тесте in vitro на первичной культуре эмбриональных фибробластов белых крыс, которая считается наиболее чувствительной тест-моделью при изучении биологического действия медицинских изделий в условиях «ускоренного старения». Цитотоксическое действие оценивали по количеству выживших клеток после добавления к ним вытяжек из изделий медицинского назначения⁴.

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных выполняли стандартными методами с использованием U-критерия Манна – Уитни и двустороннего точного критерия Фишера. Количественные значения представляли в виде медианы (Mе) в интерквартильном диапазоне [P25; P75] и считали статистически значимыми при р < 0,05. Полученные результаты сравнивали с гигиеническими нормативами (ГН), принятыми для изделий медицинского назначения⁵.

Результаты

Изучение токсических свойств изделий медицинского назначения, имеющих различную продолжительность и способ контакта с пациентами, в контрольных группах показало отсутствие пирогенного и гемолитического действий in vitro, а также сенсибилизирующего действия вытяжек на лабораторных животных. Об отсутствии цитотоксического действия свидетельствовала выживаемость клеток на уровне 91,11–93,93%.

Оценка аллергенной опасности на модели  in vitro при воспроизведении гиперчувствительности замедленного типа вытяжек из всех опытных медицинских изделий, подвергавшихся термостатированию на протяжении 3,7 суток, не выявила влияния на величины среднегрупповых показателей ТОЛМ. Увеличение периода «ускоренного старения» изделий способствовало повышению у белых мышей показателя ТОЛМ в абсолютных единицах, что позволяло дать балльную оценку. Так, групповая ТОЛМ у 7,1% (р > 0,05) и 21,4% (р < 0,05) медицинских изделий, имеющих кратковременный контакт с внутренней средой пациентов, после термостатирования в течение 11,2 и 18,7 суток составляла 0,1 и 0,2 балла соответственно по сравнению с контролем (см. таблицу). Также статистически значимые изменения выявлены у 23,8% изделий, имеющих кратковременный контакт с поверхностью тела пациентов, после 18,7 суток «ускоренного старения», их балльная оценка составила 0,2. Следует отметить повышение ТОЛМ у 9,1% изделий, имеющих длительный или постоянный контакт с внутренней средой пациентов, до 0,15 балла при р > 0,05 на фоне отсутствия такового после 11,2 суток термостатирования.

Цитотоксические свойства изделий медицинского назначения оценивали во всех группах независимо от продолжительности и способа контакта с пациентами. Термостатирование в течение 18,7 суток изделий, имеющих длительный или постоянный контакт с внутренней средой пациентов, инициировало статистически значимую гибель 7,8% клеток по сравнению с контролем. Аналогичные изменения выявлены после 11,2 и 18,7 суток «ускоренного старения» изделий, имеющих кратковременный контакт с внутренней средой пациентов. Выживаемость клеток снижалась на 12,8 и 20,8 % при р < 0,001 соответственно, в том числе у 21,4% изделий после термостатирования в течение 18,7 суток количество живых клеток составляло менее 70,0%, что определяло их цитотоксические свойства и несоответствие ГН. Наиболее выраженное цитотоксическое действие проявляли медицинские изделия, имеющие кратковременный контакт с поверхностью тела пациентов. Статистически значимая гибель 3,3% клеток по сравнению с контрольной группой изделий фиксировалась уже через 3,7 суток нахождения в условиях «ускоренного старения» и продолжала нарастать до 21,5% с увеличением периода термостатирования до 18,7 сут. При этом 9,5 и 33,3% изделий после 11,2 и 18,7 сут ускоренного старения соответственно не отвечали требованиям ГН.

Вытяжки из стерильных изделий медицинского назначения, имеющих однократный кратковременный, длительный или постоянный контакт с внутренней средой пациентов, после 3,7 сут пребывания в условиях «ускоренного старения» оставались апирогенными. Однако после 18,7 сут вытяжки из изделий, контактирующих длительно или постоянно с внутренней средой пациентов, статистически значимо повышали температуру тела кроликов на 50,0% относительно контроля. После 11,2 и 18,7 суток «ускоренного старения» изделий, кратковременно контактирующих с внутренней средой пациентов, было выявлено повышение температуры тела кроликов в 1,75  (р = 0,007) раза и 2,0 раза (р < 0,001) соответственно по сравнению с контролем. При этом для 7,1% изделий, инкубированных в течение 18,7 суток, значения температуры тела кроликов после введения вытяжек превышали ГН на 1,4 °C, что указывает на их пирогенные свойства.

Изучение гемосовместимости in vitro изделий медицинского назначения, контактирующих кратковременно, длительно или постоянно с внутренней средой пациентов, после моделирования в условиях «ускоренного старения» на протяжении 18,7 суток показало статистически значимое повышение гемолиза эритроцитов на 39,6–46,7% относительно контрольных групп. Также выявлено, что у 3,6% изделий, имеющих однократный кратковременный контакт с внутренней средой пациентов, значения гемолиза были более 2,0%, что обусловливало их недостаточную совместимость с кровью и несоответствие ГН.

Обсуждение

Все изученные одноразовые изделия медицинского назначения, имеющие различную продолжительность и способ контакта с пациентами, не оказывали сенсибилизирующего действия в тест-модели опухания лапы мыши и соответствовали ГН после пребывания в условиях «ускоренного старения». Однако установлено, что с увеличением периода «ускоренного старения» статистически значимо увеличивалось количество изделий с изменением ТОЛМ.

Статистически значимая гибель клеток первичной культуры эмбриональных фибробластов на тест-модели in vitro после добавления к ней вытяжек может быть инициирована химическими веществами, мигрирующими из изделий вследствие деградации материалов, из которых они изготовлены, после «ускоренного старения», что и объясняет несоответствие ГН. Появление пирогенных свойств изделий также может быть обусловлено миграцией химических веществ в вытяжки или следствием нарушения целостности упаковки в процессе термостатирования.

Различная степень снижения совместимости с кровью in vitro и превышение ГН некоторыми медицинскими изделиями после моделирования в условиях «ускоренного старения» указывали на невысокое качество материалов, применяемых для изготовления медицинских изделий, предназначенных для взаимодействия с внутренней средой организма пациентов.

 Ограничения исследования связаны с применяемыми тест-моделями in vitro и in vivo для оценки токсических свойств изделий после ускоренного старения, а также используемыми в экспериментах медицинскими изделиями.

Заключение

1. Токсическое действие медицинских изделий, имеющих различную продолжительность и способ контакта с пациентами, зависело от времени пребывания в условиях «ускоренного старения».
2. Наибольшая степень выраженности токсического действия установлена для медицинских изделий, имеющих кратковременный контакт с поверхностью тела пациентов, а наименьшая – изделий, контактирующих длительно или постоянно с внутренней средой пациентов.
3. Подтверждена высокая эффективность первичной культуры эмбриональных фибробластов белых крыс как тест-модели для изучения биологического действия медицинских изделий в условиях «ускоренного старения».
4. Для установления сроков годности новых медицинских изделий необходимо изучать их токсические свойства после моделирования «ускоренного старения».

¹ О комплексе предварительных технических работ, предшествующих государственной регистрации медицинских изделий: постановление Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 23 апр. 2015 г. № 55: с изм. от 9 июня 2022 г. № 52. ilex: информационно-правовая система.

² О правилах регистрации и экспертизы безопасности, качества и эффективности медицинских изделий: решение Совета Евразийской экономической комиссии от 12 февр. 2016 г. № 46: с изм. от 19 мая 2022 г. № 84. ilex: информационно-правовая система.

³ ASTM F1980-21. Standard guide for accelerated aging of sterile barrier systems and medical devices. Доступно:  https://store.astm.org/f1980-21.html

⁴ Методы гигиенической оценки медицинских изделий: инструкция по применению № 020-1118: утв. Министерством здравоохранения Республики Беларусь 25.04.2019. РУП «Научно-практический центр гигиены»; И.И. Ильюкова, С.Ю. Петрова, Т.Н. Гомолко, О.А. Борис, М.В. Анисович, В.А. Грынчак. Минск; 2019.

⁵ Гигиенический норматив «Показатели безопасности и безвредности для здоровья человека изделий медицинского назначения, медицинской техники и материалов, применяемых для их изготовления»: утв. постановлением Совета Министров Республики Беларусь от 25 янв. 2021 г. № 37. Доступно: https://rspch.by/Docs/post-37-2021.pdf