Методические приёмы изучения механизмов действия и интерпретации эффектов агонистов каппа-опиоидных рецепторов (обзор литературы)

До настоящего времени боль занимает первое место среди причин снижения качества жизни и потери трудоспособности [1]. Наиболее эффективными средствами предотвращения и купирования болевого синдрома остаются лекарственные препараты из числа агонистов µ- и δ- опиоидных рецепторов, не лишённые побочных эффектов, в том числе вызывающие лекарственную зависимость. В связи с этим поиск эффективных и безопасных анальгетиков остаётся актуальной задачей.

Одним из перспективных направлений такого поиска представляется разработка селективных агонистов к-опиоидных рецепторов (КОР) [2], обладающих наравне с агонистами µ-опиоидных рецепторов выраженным обезболивающим эффектом. Нежелательные явления (седация, дисфория, депрессии, аффективные расстройства) в 1990-е годы препятствовали широкому внедрению этих лекарственных препаратов в медицинскую практику [3]. Но в условиях значительного расширения и совершенствования биометрических моделей оценки лекарственной эффективности в настоящее время возникла необходимость дополнить представления о спектре целевой и нецелевой фармакологической активности агонистов КОР.

Современная стратегия поиска новых лекарственных средств на основе агонистов КОР фокусируется на трёх направлениях. Первое направление – разработка лигандов с преимущественно периферическим действием, обладающих низкой способностью к проникновению через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что позволяет минимизировать центральные побочные эффекты при сохранении терапевтического действия на периферии. Второе направление – разработка функционально селективных агонистов, избирательно воздействующих на внутриклеточные сигнальные пути, опосредованные ответственными за анальгезию G-белками, при снижении воздействия на β-аррестин-связанные процессы, ассоциированные с побочными эффектами. Третье направление – конструирование соединений со смешанным профилем активности, например, агонизм KOP / частичный агонизм или антагонизм к µ-опиоидным рецепторам (МОР), направленный на достижение синергизма анальгетических эффектов при одновременной блокаде MOР-опосредованных механизмов развития лекарственной зависимости и угнетения функции внешнего дыхания. Подобная стратегия определяет смещение фокуса доклинических и клинических исследований с мониторинга выраженности дисфории на подтверждение её отсутствия [4].

Анализ данных литературы показал значительное разнообразие методов оценки механизма действия и эффектов новых соединений с к-опиоидной активностью на молекулярно-клеточном и тканевом уровнях, а также на доклиническом и клиническом этапах исследования. При этом первичный скрининг in vitro и доклиническое тестирование in vivo, безусловно, являются основополагающими при разработке новых селективных агонистов КОР, однако для их интегральной оценки эффективности и безопасности необходимо обоснование минимально достаточного объёма исследований. Так, значительная методологическая вариабельность влечёт за собой разрозненность данных и затрудняет формирование единой системы прогнозирования терапевтического потенциала и профиля безопасности агонистов КОР.

Решение этой важной задачи должно быть комплексным и включать методы оценки терапевтической и дисфорической активности, в связи с чем целью настоящего исследования стала систематизация стратегий изучения механизма действия и нейротропных эффектов соединений, обладающих к-опиоидной активностью, для системной оценки их эффективности и безопасности.

Поиск литературы осуществляли с использованием баз данных Pubmed, Scopus, Web of Science, MedLine, РИНЦ и eLIBRARY. Проанализировано 62 публикации за период с 1999 по 2025 г., из которых 33 вышли с 2010 по 2019 г., 24 – с 2020 по 2025 г. В ходе анализа литературы установлено, что изучение механизмов действия и фармакологических эффектов соединений, обладающих к-агонистической активностью, включает в себя методы молекулярного и клеточного моделирования in vitro, исследование на изолированных тканях ex vivo, доклинические испытания на лабораторных животных in vivo и строго регламентированные клинические исследования. Разработка новых лекарственных препаратов на основе агонистов КОР предусматривает следующие методические подходы (рис. 1, 2).

Исследования in vitro

Методы in vitro служат важным инструментом селекции новых фармакологически активных соединений с к-опиоидной активностью. Они позволяют целенаправленно отбирать молекулы с желаемым фармакологическим профилем (высокая селективность, нужный тип функциональной активности) до перехода к дорогостоящим и сложным исследованиям in vivo.

Механизм действия агонистов КОР на молекулярно-клеточном уровне изучается сегодня на уровнях прямого взаимодействия лиганда с рецептором, функциональной активности, ионных механизмов, первичных внутриклеточных сигнальных каскадов, что предполагает использование различных инструментов, в том числе специфичных методов визуализации, электрофизиологического контроля и др.

Оценка аффинности и селективности к рецептору основана на способности связывания радиоактивно меченного селективного лиганда (например, [³H]U-69593) с рецепторами КОР в присутствии различных концентраций исследуемого соединения (радиолигандное конкурентное связывание). Анализ кривой «доза – ответ» позволяет рассчитать значение IC₅₀ (полумаксимальная ингибирующая концентрация) и константу диссоциации (K_i), характеризующие аффинность вещества к рецептору.

Оценка функциональной активности агониста КОР на клеточных линиях осуществляется, как правило, по анализу накопления циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) (активация КОР приводит к ингибированию аденилатциклазы через Gα_i/o-белки) (cAMP accumulation assay) либо с помощью репортерного анализа (Reporter Gene Assay), который позволяет количественно оценить уровень экспрессии репортерного гена в ответ на связывание лиганда с рецептором. Снижение уровня цАМФ приводит к активации транскрипционного фактора CREB, инициирующего синтез репортерного белка (например, люциферазы), уровень которого легко детектируется и пропорционален уровню активности рецептора (то есть селективности агониста к КОР).

Детализация функциональной селективности того или иного агониста КОР предусматривает установление степени активации G-белка либо β-аррестин-специфических сигнальных каскадов. Доказано, что сигнальный путь через G-белки опосредует терапевтические эффекты, а рекрутирование β-аррестина определяет побочное действие (дисфория, седация) [5], поэтому современная стратегия разработки агонистов KOР сместилась от поиска высокоаффинных лигандов к созданию соединений с направленной функциональной селективностью (так называемый biased agonism) [6–8], а ключевым методическим подходом остаётся сравнительный анализ их активирующего потенциала через G-белковую сигнализацию или рекрутирование β-аррестина. Чаще всего этот сравнительный анализ выполняют по уровню люминесценции на культурах клеток, полученных методом генной инженерии. Для анализа функциональной активности G-белка может быть использован биосенсор GloSensor (Promega), работа которого основана на принципе изменения люминесценции модифицированной люциферазы светлячка в зависимости от концентрации цАМФ. Активацию аррестинового пути оценивают с помощью биосенсора Tangо. Биосенсор Tango получают путём модификации клеток HEK293, стабильно экспрессирующих цАМФ-зависимую люциферазу светлячка (firefly luciferase). Эти клетки дополнительно модифицируются путём трансфекции плазмидами, кодирующими слитые белки КОР и биосенсор в соотношении 1 : 1. Один из слитых белков состоит из КОР, к С-концу которого с помощью линкера, представляющего собой сайт расщепляемый протеазой вируса табачной мозаики (Tobacco Etch virus, TEV), присоединён фактор транскрипции, необходимый для активации репортерного гена, которым в данном биосенсоре является ген люциферазы. Второй слитый белок представляет собой комбинацию из протеазы TEV и β-аррестина. Активация КОР приводит к рекрутированию β-аррестина-2, слитого с протеазой TEV, которая гидролизует линкер и высвобождает фактор транскрипции, делая его доступным для индукции экспрессии люциферазы. Полученные данные применяют для построения кривых зависимости «концентрация агониста – интенсивность люминесценции» с определением коэффициента трансдукции, отражающего сродство лиганда к определённому сигнальному пути (log (τ/KA)) и расчёта средних эффективных концентраций исследуемого соединения по способности активировать G-белок и β-аррестин-зависимые пути [9]. Отношение этих величин рассматривают в качестве интегрального показателя безопасности. Несмотря на высокую информативность такого метода, он имеет ограничения, связанные с повышенными требованиями к лаборатории и дорогостоящим оборудованием.

Альтернативным методом служит оценка ионных механизмов действия агонистов КОР на клеточных культурах с регистрацией электрофизиологических показателей. Например, технику локальной фиксации потенциала (patch-clamp) применяют для регистрации уровня токов ионов кальция (через N-тип Ca²⁺-каналов) и калия (через GIRK-каналы). Подавление кальциевой и усиление калиевой проводимости лежат в основе торможения нейрональной возбудимости и являются ведущими ионными механизмами агонистов КОР.

Несмотря на постоянное совершенствование методов подтверждения механизмов действия вновь синтезированных соединений с к-опиоидной активностью, многие научные работы, посвящённые межвидовым различиям нейронных систем и их реакций на опиаты, носят противоречивый характер. Поэтому разработка инновационных экспериментальных моделей, в том числе культивирование человеческих и животных ноцицепторов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), сохраняет актуальность. Röderer P. и соавт. отмечают, что такая технология позволяет оценить влияние агонистов на внутриклеточные сигнальные пути в нейронах и установить клеточные и молекулярные основы их нежелательных эффектов. Авторы подчёркивают, что человеческие и животные ноцицепторы, полученные из iPSC, представляют собою уникальную модель для исследования молекулярных и клеточных механизмов в сенсорных нейронах, которые труднодоступны для классического изучения. Данная система in vitro более точно воспроизводит естественные внутриклеточные процессы, в том числе сигнальные пути и регуляторные механизмы, но требовательна к условиям эксперимента и нюансам используемой технологии [2].

В качестве инновационных методов особого внимания заслуживают технологии с использованием трансляционных платформ: «орган-на-чипе» (organ-on-a-chip, OoC) и «человек-на-чипе» (human-on-a-chip, HoC). Эти технологии сочетают в себе тканевую инженерию и микрофлюидику и воссоздают среду, имитирующую физиологическую систему исследуемых тканей и систем органов, и могут быть использованы для изучения кинетики (ADME-профиля) и фармакодинамики лекарственных средств при моделировании патологических состояний [10]. Авторы работы указывают на актуальность использования такого подхода ввиду его высокого трансляционного потенциала. Так, подчёркнуто, что в ходе клинических испытаний 9 из 10 новых лекарственных соединений вызывают непредсказуемые побочные эффекты, которые в большинстве случаев учесть заранее невозможно из-за межвидовых различий. Применение же технологий OoC и HoC для изучения эффектов и кинетики агонистов КОР в настоящее время ограничено, а для их масштабного использования требуется преодоление ряда технических и методических проблем, в числе которых стандартизация протоколов, оптимизация условий культивирования и валидация полученных результатов.

Исследования ex vivo в сочетании с in vivo

Нейрофармакологические подходы ex vivo в сочетании с in vivo направлены на изучение влияния агонистов КОР на функции нервной системы и регуляцию поведенческих механизмов.

Гистохимические методы (авторадиография и иммуногистохимия) позволяют визуализировать и точно картировать распределение KOР в срезах головного и спинного мозга, периферических нейронах с использованием меченых лигандов или специфических антител. Применение такого специфичного метода визуализации, как позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) с использованием высокоселективных радиолигандов, позволяет получать исчерпывающие данные о распределении КОР у разных видов животных, что способствует существенному увеличению точности прогноза при трансляции экспериментальных данных на человека. Так, с использованием высокоселективного агониста [11C]GR103545 были установлены значительные различия в локализации и плотности распределения КОР у человека и приматов. У людей наибольшее скопление радиолиганда наблюдалось в миндалевидном теле [11], а у нечеловекообразных приматов – в поясной коре и стриатуме [12], также было отмечено, что метаболизм исследуемого агониста у человека протекает значительно медленнее, чем у животных. Методом ПЭТ-визуализации могут быть построены дозозависимые кривые достижения оптимального терапевтического действия, выполнена оценка влияния полиморфизмов гена OPRK1 на связывание лигандов, изучены фармакокинетика и биодоступность соединений у животных и человека, функциональная селективность агонистов (активация G-белкового пути или β-аррестина), а также определена корреляция между параметрами связывания лигандов с рецепторами и паттернами поведенческих реакций.

Особого внимания заслуживает подход, основанный на машинном обучении, демонстрирующий высокую эффективность в кластерной стратификации данных, получаемых методом ПЭТ [13, 14]. С помощью такого подхода осуществляется кластеризация (ранжирование) k-средних, что в конечном итоге обеспечивает повышение точности прогнозирования индивидуальных реакций в ответ на применение опиоидных препаратов.

При использовании электрофизиологических методов достигается возможность регистрации активности отдельных нейронов (нейронных ансамблей) в мозге анестезированного или бодрствующего животного. Так, их использование позволяет оценить уровень возбудимости нейронов в отдельных областях мозга в ответ на активацию рецепторов КОР. Показано, что имплантация корковых и глубоких электродов в мозг крыс позволяет регистрировать LFP-активность нейронов, что даёт представление о механизмах передачи потока информации по нейронным сетям и их взаимодействии [15].

Примером высокой информативности электрофизиологических методов для уточнения КОР-сигналинга служит работа [16], в которой с помощью локальной фиксации потенциала (patch-clamp) зарегистрирована динамика возбудимости и синаптической передачи ГАМК-эргических нейронов 5-го слоя островковой доли головного мозга и нейронов чёрной субстанции после введения динорфина А. Установлено, что активация КОР приводит к ингибированию ГАМК-эргической нейропередачи и повышению уровня глутамата в этих структурах. Вследствие воздействия на дофаминергическую систему обеспечивается возможность регуляции мотивации и эмоционального подкрепления (система награды / отвращения), включая механизмы аддикции [16].

Использование нейрохимических методов (микродиализ) позволяет определять концентрацию нейромедиаторов (дофамина, глутамата, ацетилхолина) во внеклеточной жидкости, отобранной из специфических областей мозга (например, прилежащее ядро, стриатум) живого животного, в различные сроки после введения агониста КОР. С помощью этих методов можно объяснить нейрохимическую основу поведенческих эффектов. Так, доказано, что активация к-опиоидной системы снижает мезокортиколимбическую дофаминергическую и глутаматергическую нейротрансмиссию и таким образом опосредует развитие отрицательных эмоций [17].

Все вышеперечисленные методы предоставляют значительный объём данных, но остаются недостаточными для установления терапевтических и нежелательных эффектов соединений с к-опиоидной активностью, что делает необходимым проведение углублённого исследования in vivo. На рис. 2 представлена блок-схема, отражающая оптимальный набор методов изучения эффектов агонистов КОР в опытах на животных моделях.

Исследования in vivo

Для доказательства специфичности к-опосредованного эффекта новых соединений широко применяются методы, предусматривающие использование трансгенных линий животных с нокаутом или активацией целевого гена (например, ARRВ2, OPRK1^–/^– и др.) [18]. В обзоре К.Ю. Калитина и соавт. представлены различные модели нейровоспаления, основанные на использовании трансгенных мышей с эксцизионной активацией гена IL-1β, нокаутом гена TGF-β, экспрессией антител к фактору роста нервов (NGF) и др. для установления противовоспалительного, иммуносупрессивного и нейропротективного эффекта агонистов КОР (налфурафин, U50,488) [19].

Изучение нейротоксического профиля новых агонистов КОР методом фармакологического зондирования позволяет установить связь активации к-опиоидной системы с другими нейромедиаторными системами. Известно, что активация КОР приводит к дисбалансу в функционировании дофамин-, серотонин-, глутамат- и ГАМК-эргической нейромедиации, что является центральным патогенетическим звеном в формировании широкого спектра психогенных эффектов. Например, снижение концентрации внеклеточного дофамина характерно для дисфорических состояний [20], модуляция моноаминергических путей является основной причиной аффективных расстройств [21], ингибирование глутаматергических механизмов приводит к развитию диссоциации и седации [22]. Метод фармакологического зондирования заключается в оценке выраженности у животных поведенческих, нейрохимических или физиологических реакций, индуцированных введением селективных к различным нейромедиаторным системам лигандов, в присутствии агониста КОР [23].

Доклиническое изучение терапевтических свойств новых агонистов КОР (например, обез-боливающее, противозудное, антиаддиктивное действие) предусматривает проведение исследований на мелких лабораторных животных, в том числе генно-модифицированных линий, с применением специфичных методов оценки целевой активности. Так, изучение обезболивающего действия проводят на моделях острой (тесты «отдёргивание хвоста», «горячая пластина»), хронической, нейропатической (хроническое сужение нерва, спинальная лигатура, тест с формалином) и висцеральной боли (инъекция уксусной кислоты) [24–27]. Данные модели обеспечивают валидные результаты и являются золотым стандартом оценки анальгетической активности новых средств. Критерием эффективности служит отсутствие реакции на болевой стимул [26]. Оценку противозудной активности осуществляют на моделях индуцированного зуда, например, с использованием хлорохина.

Изучение безопасности новых агонистов КОР предусматривает использование следующей батареи тестов: первичное наблюдение, открытое поле, ротарод, тесты на анальгетическую активность, регистрация тремора, судорог, реакции Штраубе, сохранности слухового, роговичного, сгибательного рефлексов, температуры тела, саливации, пилоэрекции, птоза, экзофтальма, цианоза кожных покровов [28].

В настоящее время разработан и запатентован (патент RU 2801892) новый способ экспресс-оценки безопасности агонистов КОР, включающий мониторинг шести специфических симптомов, характерных для активации КОР (гиполокомоция, распластывание, пячение, вокализация, гипотермия и полиурия), и двух – для активации µ-опиоидной нейромедиации (кататоническая ригидность хвоста, кататонический ступор). Проявление шести к-опосредованных эффектов в сочетании с анальгезией и одновременным отсутствием µ-опосредованных симптомов позволяет выполнить тестирование препарата на специфичность и безопасность в сжатые сроки [29].

Методология экспериментального изучения влияния агонистов КОР на эмоциональные формы поведения включает исследование реакций животного на электрическую стимуляцию мозга (интракраниальная самостимуляция, ICSS, реакция электрической самостимуляции, РСС), реакций на интракраниальное самовведение, ICSA, изучение условной реакции предпочтения или избегания места, изучение динамики обмена эндогенных лигандов, участвующих в механизмах «награды». С помощью этих методов можно изучить не только нейрональные механизмы, но и оценить аддиктивный или антиаддиктивный потенциал соединений.

Высокой прогностической ценностью обладают методы ICSS [30] и РСС [31, 17] с применением камеры Скиннера (Skinner Box). Оба метода основаны на отслеживании оперантного поведения животного при электрической стимуляции различных зон мозга, сопряжённых с системой вознаграждения. Суть метода состоит в обучении животного нажимать на рычаг, вследствие чего создаётся положительное подкрепление, вызванное прямой стимуляцией центров мозга (например, медиального пучка переднего мозга или латерального гипоталамуса) через вживлённый электрод, и дальнейшей оценке влияния соединений на систему вознаграждения по таким ключевым параметрам, как порог самостимуляции (по амплитуде или частоте импульсов), частота и скорость нажатия на рычаг. При этом метод ICSS предусматривает оценку скорости реакции при разных частотах стимуляции, а РСС – определение минимальной силы тока (пороговую интенсивность), которая необходима для поддержания выработанной условной реакции, на основе измерения возбудимости нейронной цепи [30].

Известно, что вещества с высоким аддиктивным потенциалом значительно повышают поведенческую активность, что отражается в увеличении частоты и скорости нажатия на рычаг, а при длительном воздействии обусловливают повышение порога самостимуляции. Аверсивное действие соединений выражается в подавлении поведения, направленного на получение вознаграждения, даже при выраженной мотивации, и отказе от самостимуляции. Активация к-опиоидной нейромедиаторной системы лежит в основе долгосрочного снижения чувствительности системы вознаграждения [31].

В работе Banks M.L. приведены результаты изучения антиаддиктивного действия широкого ряда агонистов КОР (U69,593, налфурафин, сальвинорин А, U50,488, энадолин, бремазоцин и пр.) методом ICSA. Было установлено, что агонисты КОР снижают уровень потребления наркотических веществ, вызывая эффект негативного подкрепления. В условиях их хронического введения наряду со снижением потребления наркотиков наблюдалось и снижение пищевого подкрепления, что свидетельствовало об отсутствии терапевтической избирательности и риске возникновения дополнительного побочного эффекта в виде нарушения пищевого поведения [17].

Хорошо зарекомендовавшей себя моделью для изучения аддиктивных свойств новых соединений является метод оценки условной реакции предпочтения места (УРПМ) [32]. Он основан на выработке у грызунов условного предпочтения нахождения в отсеке камеры, ассоциированном с положительным подкреплением (например, введением наркогена). Увеличение времени в исходно не предпочитаемом отсеке камеры трактуется как условное предпочтение места. Дополнительным критерием предпочтения служит общее увеличение числа переходов из отсека в отсек [33].

Оценку побочного действия агонистов КОР проводят с применением методов, позволяющих определить уровень локомоции животных. Доказано, что активация КОР у грызунов связана с двигательными нарушениями [3], что обосновывает использование опиоид-индуцированной седации у грызунов в качестве маркёра биологического ответа на введение агониста и одновременно позволяет определить диапазон пороговых значений по локомоторным расстройствам. Такие эффекты, как гиподинамия и седация, оценивают в тестах «прямое наблюдение» (визуальный контроль), «открытое поле» и «актометр». Состояние моторно-координационной функции у крыс и мышей изучают в тесте "ротарод". Суть метода заключается в помещении животного на вращающийся стержень, время удержания на котором отражает уровень седации по степени мышечного расслабления и по нарушению координации движений [26].

Для комплексной оценки депрессивных состояний в доклинических исследованиях анализируют проявления тревожно-подобного поведения в тестах «открытое поле» [34] и «приподнятый крестообразный лабиринт» [35]. Как признаки тревожного или дисфорического состояния в первом тесте оценивают снижение исследовательской активности и избегание центральной зоны арены, а во втором – увеличение времени, проведённого в закрытых рукавах лабиринта.

Наличие или отсутствие депрессивного действия агонистов КОР можно оценить в тестах «принудительное плавание» [36] и «подвешивание за хвост» [35] по периоду неподвижности животных в результате отсутствия мотивации к самоспасению, что интерпретируется как проявление поведенческого отчаяния. Так, в работе [35] агонист U50,488 у животных вызывал депрессивно-подобное поведение, проявляющееся ростом неподвижности при подвешивании за хвост. В обзоре Dalefield M.L. и соавт. отмечено, что сальвинорин А и U50,488 также характеризовались депрессивным действием в отличие от менее селективного агониста КОР коллиболида, выделенного из гриба Collybia maculate S. и триазола [37].

Модификацией теста УРПМ является тест «условного избегания (отвращения) места» (УРИМ), основанный на избегании животными отсека камеры, ассоциированного с негативным воздействием (например, введением агониста КОР). В работе Wei Y.Y. и соавт. на примере высокоселективных агонистов КОР SLL-039 и SLL-120 доказано, что эта модификация теста является наиболее подходящей моделью для определения дисфорического действия соединений с к-опиоидной активностью [26].

Для измерения когнитивных искажений используется тест на аффективную предвзятость (ABT-test). Суть метода заключается в определении того, как эмоциональное состояние животного, индуцированное исследуемым соединением, влияет на формирование когнитивного следа (поиск вознаграждения в различных субстратах) во время обучения и на последующий выбор субстрата с положительным подкреплением в тестовой сессии. Любое смещение выбора трактуется как когнитивное искажение, вызванное аффективным действием исследуемых веществ [38].

Оценка акустической реакции вздрагивания (стартл-реакции) и реакции престимульного торможения у грызунов позволяет выявить изменение восприятия и обработки сенсорной информации [39, 40]. Акустическая реакция вздрагивания представляет собой рефлекторный нейромышечный комплекс в ответ на внезапный звуковой стимул. Эта рефлекторная реакция даёт представление о состоянии процесса сенсорной обработки и функции внимания, которые часто нарушаются вследствие психотических реакций, таких как делирий, галлюцинации, ангедония, психоз. Престимульное торможение служит мерой измерения сенсорной фильтрации, показывающей, насколько подавляется стартл-реакция при предшествующем звуковом сигнале (престимуле), не вызывающем вздрагивания [41–43]. Так, в исследовании Bortolato M. и соавт. продемонстрировано, что введение агониста КОР U50,488 сопровождается дозозависимым угнетением престимульного торможения, но при этом не влияет на амплитуду акустической реакции вздрагивания крыс. Эти данные подтверждают роль к-опиоидной нейромедиации в эмоциональной и когнитивной регуляции [44].

Видовая специфика поведенческих реакций, выражающаяся в дивергенции эффектов (побочное действие агонистов КОР у грызунов характеризуется преимущественно седацией, тогда как у человека преобладают аффективные расстройства, в том числе дисфория и психоделические состояния), делает необходимым изучение новых агонистов КОР на крупных лабораторных животных, в том числе приматах. У последних КОР-опосредованные эффекты наиболее схожи с человеком и чаще всего реализуются через лимбическую систему, дисфункция которой сопряжена с дисфорией и стрессом [45, 46].

Традиционно основным способом оценки психомоторных нарушений на крупных животных является метод прямого наблюдения и разработанные в отдельных исследовательских лабораториях тесты на сохранность условных рефлексов. При этом следует отметить весьма ограниченное количество публикаций, посвящённых оценке эффектов агонистов КОР на кроликах и минипигах, что, вероятнее всего, связано с трудностью разработки валидированных методов изучения у них поведения и психомоторных нарушений [47].

Число публикаций, отражающих изучение терапевтических и побочных эффектов агонистов КОР на обезьянах, значительно больше. Исследования на приматах преимущественно посвящены анальгетической, противозудной и антиаддиктивной активности агонистов КОР, однако встречаются исследования плейотропных эффектов [48], таких как эффекты дискриминантного стимула [49], седация [50], нейроэндокринные эффекты [51], диурез [52], кардиопротекция и противовоспалительное действие [53].

Поскольку снижение уровня поведенческой активности при активации КОР является важнейшим маркёром психоэмоционального состояния животного, измерение опиоид-индуцированной седации на крупных животных представляется весьма важной задачей, которая решается путём наблюдения за ними в условиях свободного перемещения. Регистрируют изменение естественной позы, тонус мышц, признаки аномальной походки, сенсомоторные реакции на внешние стимулы (звуковые, световые, пищевые, болевые), сохранность сформированных навыков. Так, в работе [54] метод ежедневного мониторинга состояния признается ключевым для выявления эмоциональных и вегетативных реакций при изучении эффектов опиоидов.

Изучение влияния агонистов КОР на когнитивную функцию и такие её формы, как мотивация, исследовательское поведение, способность к сложному манипулированию, на низших приматах осуществляют в тестах «этологическое протоколирование», «устойчивость навыка», «реакция на новый объект», «прозрачный экран», «притягивание приманки» и др. [55, 56].

Клинические исследования

Алгоритм клинических исследований соединений с к-опиоидной активностью включает изучение эффективности, переносимости, безопасности и токсикокинетики на здоровых добровольцах (фаза I) и рандомизированные испытания при нозологических состояниях и патологиях (хроническая или послеоперационная боль [57], хронический зуд [58], психические расстройства [59], вазомоторные нарушения у женщин в период менопаузы [60] (фаза II/III).

Методы изучения терапевтических эффектов регламентированы международными правилами и проводятся с использованием валидированных шкал. Например, для оценки интенсивности болевого синдрома применяют визуальную аналоговую шкалу (ВАШ): испытуемые отмечают интенсивность болевых ощущений в балльной системе от 0 (отсутствие боли) до 10 (нестерпимая боль). Для оценки интенсивности зуда используют визуальную аналоговую, рейтинговую и вербальную рейтинговую шкалы, а также различные опросники. Субъективные отчёты пациентов дополняются объективными методами регистрации их состояния.

В настоящее время клинические испытания агонистов КОР включают и методы нейровизуализации, такие как функциональная магнитно-резонансная томография (фМРТ). Данный метод позволяет в режиме реального времени определять активацию различных областей головного мозга в ответ на введение исследуемого соединения, в том числе в нейрональных зонах, ассоциированных с эмоциональными реакциями. Так, если в качестве нозологии рассматривать болевой синдром, то с помощью ВАШ фиксируют субъективное восприятие боли, а методы нейровизуализации используют для объективизации взаимосвязи этого восприятия и активности нейрональных зон. Такой комплексный подход создаёт основу для принятия решения о целесообразности следующих этапов исследования при разработке нового к-опиоида со сведением к минимуму рисков возникновения побочных эффектов.

В ходе проведения клинических испытаний метод ПЭТ-визуализации существенно расширяет представления о механизме действия исследуемого соединения, его фармакокинетике и распределении, индивидуальной вариабельности ответа. В работе [61] при использовании ПЭТ-визуализации зафиксирован более низкий объём распределения КОР в миндалевидном теле (амигдале) у людей с алкогольной зависимостью по сравнению с испытуемыми, не злоупотребляющими алкоголем. О важности персонифицированного подхода в лечении алкогольной зависимости свидетельствуют результаты исследования [14], в котором с применением ПЭТ-визуализации в шести областях мозга были обнаружены различия в распределении подтипов КОР у разных групп пациентов и сделан вывод о высокой диагностической значимости метода для установления взаимосвязи между активацией КОР и психической зависимостью.

При оценке безопасности в рамках проведения I фазы клинических исследований фиксируют частоту возникновения и развития нежелательных явлений по жалобам испытуемых, данные физикального осмотра, клинически значимые изменения жизненно важных показателей (артериальное давление, частота сердечных сокращений и дыхания, температура тела), а также отклонения лабораторных показателей, параметров функции внешнего дыхания и электрокардиограммы от референтных значений.

Изучение дисфорических эффектов представляется неотъемлемой и чрезвычайно важной частью клинических испытаний новых агонистов КОР, поэтому данному блоку исследований уделяется особое внимание.

Основной методологический подход включает стандартизированные шкалы для количественной оценки субъективных переживаний. Это визуальные аналоговые шкалы используют для экспресс-оценки выраженности дисфории, тревоги и страха, опросник профиля настроений, выявляющий изменения по шкалам «напряжение – тревога», «депрессия – уныние» и «гнев– враждебность», а также специализированные опросники для детализации изменённых состояний сознания (оценивают изменение восприятия по таким параметрам, как «ошеломлённость», «изменение восприятия времени» и «мистицизм»).

Эта оценка дополняется нейрокогнитивным тестированием (тесты на внимание и скорость обработки информации, рабочую память и исполнительные функции, зрительно-пространственные функции), а также самооценкой (предоставление возможности испытуемому описать состояние своими словами).

Для минимизации рисков и установления терапевтического индекса важен дизайн исследования. Введение плацебо-контроля позволяет отделить эффекты целевого препарата от тревожности, связанной, например, с участием в испытании. Группа активного контроля (приём препаратов сравнения с известным профилем психотропной активности в низких дозах) необходима для так называемой «калибровки» ожидаемых эффектов и последующего сравнения с эффектами исследуемого препарата. Использование такого подхода, как эскалация дозы (медленное титрование дозы), позволяет точно и своевременно определить «потолок» переносимости. Перекрёстные схемы повышают вероятность выявления изменений настроения у одного и того же испытуемого при введении ему препарата и плацебо в разное время.

Подобный подход, сочетающий в себе различные способы исследований, – от субъективных клинических оценок по шкалам до объективной функциональной нейровизуализации с отслеживанием психического статуса испытуемого – представляет собой важнейший инструмент для глубокого понимания механизмов действия, терапевтической активности и безопасности лекарственных средств на основе агонистов КОР.

Заключение   

Проведённый анализ данных литературы свидетельствует о существовании многоуровневого подхода к изучению механизма действия и фармакологических эффектов агонистов КОР. Данный подход интегрирует методы молекулярного и клеточного моделирования in vitro, исследования на изолированных тканях ex vivo, доклинические испытания in vivo и строго регламентированные клинические исследования. Дуализм нейрофармакологического профиля агонистов KOР, сочетающий выраженный терапевтический потенциал (анальгезия, противозудный эффект) с проконфликтными психоделическими эффектами, определяет ключевые направления разработки новых препаратов на основе этих веществ. В фокусе современных исследований находятся создание функционально-селективных агонистов (biased agonism), разработка периферических лигандов с низкой способностью преодолевать ГЭБ, конструирование соединений со смешанным профилем активности (например, агонизм KOP / частичный агонизм или антагонизм MOР).

Современные доклинические исследования должны проводиться с использованием методов изучения эффективности in vitro: ПЭТ для визуализации распределения рецепторов и связывания лигандов, электрофизиологических методов (patch-clamp) для изучения модуляции нейрональной активности, трансляционных платформ на основе человеческих iPSC-производных нейронов для создания релевантных человеческих моделей и изучения механизмов действия, машинного обучения для анализа большого массива данных и предсказания эффектов in vivo по параметрам in vitro.

Доклинические исследования in vivo остаются фундаментом изучения фармакодинамики новых агонистов КОР. В настоящее время исследования направлены на модификацию стандартизированных моделей оценки терапевтической активности для повышения их прогностической ценности, включая стандартизацию условий, использование генетически модифицированных животных и комбинированные протоколы (одновременная или последовательная оценка эмоционального состояния, нейрокогнитивных функций и отдельных форм поведения у лабораторных животных в нескольких поведенческих тестах). Такие поведенческие тесты, как «условное избегание места», «подвешивание за хвост», «принудительное плавание» и «открытое поле», остаются золотым стандартом оценки дисфорического и депрессивного действия агонистов КОР. Достаточно высокой прогностической значимостью для выявления психотомиметической активности обладает метод акустической реакции вздрагивания и престимульного торможения.

Подтверждающей основой ранее высказанных предположений становятся клинические исследования, которые обязательно должны включать не только оценку терапевтической эффективности агонистов КОР, но и тщательный мониторинг психоэмоционального статуса испытуемых с применением валидированных психометрических шкал, нейрокогнитивного наблюдения и количественной оценки потенциальных дисфорических и седативных эффектов.