Новые трёхмерные модели in vitro для оценки токсичности углеродных нанотрубок

Введение. В последние годы проявляется интерес к трёхмерным клеточным моделям, которые более точно отражают условия in vivo и могут стать альтернативой экспериментам на животных при оценке токсичности наноматериалов. Существует необходимость в разработке 3D-моделей дыхательных путей человека, которые смогут заполнить пробел между традиционными клеточными культурами in vitro и лабораторными животными.

Материал и методы. Разработаны моно- и совместные 3D-модели на основе клеток бронхиального эпителия BEAS-2B и фибробластов легких MRC5-SV40. В качестве материалов для исследования использовали очищенные и неочищенные от металлических примесей углеродные нанотрубки (УНТ) российского производства: ОУНТ TUBALL™ и МУНТ Таунит-М. Диапазон исследуемых концентраций включал концентрации, соответствующие реальным производственным экспозициям (0,0006–100 мкг/мл). Для оценки цитотоксичности УНТ в клеточных моделях определяли уровень активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) через 72 ч экспозиции.

Результаты. Цитотоксические эффекты УНТ в 2D- и 3D-клеточных моделях проявились в разных диапазонах концентраций: трехмерная модель клеток бронхиального эпителия оказалась более чувствительной к воздействию УНТ по сравнению с монослойной, тогда как в сфероидной модели фибробластов был отмечен более высокий порог цитотоксичности для многостенных углеродных нанотрубок, по сравнению с традиционной клеточной культурой. В трёхмерной совместной культуре клеток значимое повышение ЛДГ наблюдалось, начиная с более высоких концентраций, по сравнению с монокультурами.

Ограничения исследования. Настоящее исследование было ограничено использованием одного типа теста на цитотоксичность при изучении влияния УНТ на клетки дыхательной системы.

Заключение. Разработан способ трехмерного культивирования клеток дыхательной системы человека для моделирования взаимодействия эпителиальных и стромальных клеток нижних дыхательных путей. Традиционные 2D-клеточные модели могут демонстрировать заниженные или завышенные оценки токсичности материалов. Усовершенствованные 3D- модели in vitro, приближенные по своим свойствам и морфологии к нативной ткани, обладают большей надёжностью при определении токсических доз и мишеней.

Соблюдение этических стандартов. Исследование не требует представления заключения комитета по биомедицинской этике или иных документов.

Участие авторов:
Габидинова Г.Ф. — разработка подходов культивирования трёхмерных моделей, проведение тестов на клетках, обзор литературы, статистическая обработка данных, обобщение полученных результатов, написание текста;
Тимербулатова Г.А. — культивирование клеток, проведение тестов на клетках, обобщение полученных результатов, редактирование;
Убейкина Е.В. — обзор литературы, культивирование клеток, обработка данных;
Саягфарова А.А. — обзор литературы, проведение тестов на клетках, обработка данных;
Фатхутдинова Л.М. — дизайн исследования, анализ материала, редактирование.
Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда № 22-25-00512.
https://rscf.ru/project/22-25-00512/

Дата поступления: 09 сентября 2023 / Дата принятия в печать: 03 декабря 2023 / Дата публикации: 29 декабря 2023

1. Eatemadi A., Daraee H., Karimkhanloo H., et al. Carbon nanotubes: properties, synthesis, purification, and medical applications. Nanoscale Research Letters. 2014; 9(1): 393. https://doi.org/10.1186/1556-276X-9-393

2. Nurazzi N.M., Asyraf M.R.M., Khalina A., et al. Fabrication, Functionalization, and Application of Carbon Nanotube-Reinforced Polymer Composite. An Overview. Polymers (Basel). 2021; 13(7): 1047. https://doi.org/10.3390/polym13071047

3. Liu Z., Tabakman S., Welsher K., Dai H. Carbon nanotubes in biology and medicine: In vitro and in vivo detection, imaging and drug delivery. Nano Res. 2009; 2(2): 85–120. https://doi.org/10.1007/s12274-009-9009-8

4. NANoREG. Grant Agreement Number 310584. Deliverable D 2.06. Validated protocols for test item preparation for key in vitro and ecotoxicity studies. Due date of deliverable: 2016/01/31 (approved postponement). Actual submission date: 2016/03/24.

5. Pfuhler S., van Benthem J., Curren R., et al. Use of in vitro 3D tissue models in genotoxicity testing: Strategic fit, validation status and way forward. Report of the working group from the 7th International Workshop on Genotoxicity Testing (IWGT). Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2020; 850–1. 503135. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2020.503135

6. de Dios-Figueroa G.T., Aguilera-Marquez Jd.R., Camacho-Villegas T.A., Lugo-Fabres P.H. 3D Cell Culture Models in COVID-19 Times: A Review of 3D Technologies to Understand and Accelerate Therapeutic Drug Discovery. Biomedicines. 2021; 9(6): 602. https://doi.org/10.3390/biomedicines9060602

7. Kronemberger G.S., Carneiro F.A., Rezende D.F., Baptista L.S. Spheroids and organoids as humanized 3D scaffold-free engineered tissues for SARS-CoV-2 viral infection and drug screening. Artif Organs. 2021; 45(6): 548–58. https://doi.org/10.1111/aor.13880

8. Juarez-Moreno K., Chávez-García D., Hirata G., Vazquez-Duhalt R. Monolayer (2D) or spheroids (3D) cell cultures for nanotoxicological studies? Comparison of cytotoxicity and cell internalization of nanoparticles. Toxicol In Vitro. 2022; 85: 105461. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2022.105461

9. Li J., Diamante G., Ahn I.S., et al. Determination of the nanoparticle- and cell-specific toxicological mechanisms in 3D liver spheroids using scRNAseq analysis. Nano Today. 2022; 47: 101652. https://doi.org/10.1016/j.nantod.2022.101652

10. Movia D., Prina-Mello A., Bazou D., Volkov Y., Giordani, S. Screening the Cytotoxicity of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Novel 3D Tissue-Mimetic Models. ACS Nano. 2011; 5(11): 9278–90. https://doi.org/10.1021/nn203659m

11. Hindman B., Ma Q. Carbon nanotubes and crystalline silica induce matrix remodeling and contraction by stimulating myofibroblast transformation in a three-dimensional culture of human pulmonary fibroblasts: role of dimension and rigidity. Arch Toxicol. 2018; 92(11): 3291–305. https://doi.org/10.1007/s00204-018-2306-9

12. Kabadi P.K., Rodd A.L., Simmons A.E., Messier N.J., Hurt R.H., Kane A.B. A novel human 3D lung microtissue model for nanoparticle-induced cell-matrix alterations. Part Fibre Toxicol. 2019; 16(1): 15. https://doi.org/10.1186/s12989-019-0298-0

13. Barosova H., Karakocak B.B., Septiadi D., Petri-Fink A., Stone V., Rothen-Rutishauser B. An In Vitro Lung System to Assess the Proinflammatory Hazard of Carbon Nanotube Aerosols. Int J Mol Sci. 2020; 21(15): 5335. https://doi.org/10.3390/ijms21155335

14. Wang Y., Bahng J.H., Che Q., Han J., Kotov N.A. Anomalously Fast Diffusion of Targeted Carbon Nanotubes in Cellular Spheroids. ACS Nano. 2015; 9(8): 8231–8. https://doi.org/10.1021/acsnano.5b02595

15. Anisimov R.A., Gorin D.A., Abalymov A.A. 3D Cell Spheroids as a Tool for Evaluating the Effectiveness of Carbon Nanotubes as a Drug Delivery and Photothermal. Therapy Agents. C. 2022; 8(4): 56. https://doi.org/10.3390/c8040056

16. Тимербулатова Г.А., Дунаев П.Д., Димиев А.М., Габидинова Г.Ф., Хаертдинов Н.Н., Фахруллин Р.Ф., Бойчук С.В., Фатхутдинова Л.М. Сравнительная характеристика различных волокнистых материалов в экспериментах in vitro. Казанский медицинский журнал. 2021; 102(4): 501–9. https://doi.org/10.17816/KMJ2021-501

17. The R Project for Statistical Computing. URL: https://www.R-project.org/ (accessed: 13.09.2023).

18. Габидинова Г.Ф., Тимербулатова Г.А., Даминова А.Г., Галялтдинов Ш.Ф., Димиев А.М., Крючкова М.А., Фахруллин Р.Ф., Фатхутдинова Л.М. Оценка воздействия промышленных одностенных и многостенных углеродных нанотрубок на культуры эпителиальных клеток дыхательных путей человека. Гигиена и санитария. 2022; 101(12): 1509–20. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2022-101-12-1509-1520