Экспериментальная оценка и математическое моделирование комбинированной цитотоксичности свинца и меди in vitro на клетках нейробластомы IMR-32

Введение

Химическое загрязнение воздуха рабочей зоны ряда промышленных предприятий, как правило, представляет собой многокомпонентную смесь веществ, комбинированное действие которых может значимо отличаться от их изолированного действия и оказывать различный токсический эффект. Существующий риск усиления токсического эффекта при действии комбинации веществ со схожим механизмом действия, например, обладающих нейротоксичностью, обусловливает высокую актуальность оценки комбинированного действия.

Наиболее типичными нейротоксикантами являются свинец (Pb) и медь (Cu), которые загрязняют как рабочие зоны металлургических предприятий, так и прилегающие к ним территории. Известно, что Pb оказывает полисистемное неблагоприятное воздействие, особенно негативно влияет на ЦНС, вызывая когнитивные, слуховые, координационные и зрительные нарушения [1, 2]. Негативное воздействие Pb выступает причиной ряда нейродегенеративных патологий [3]. Cu же, с одной стороны, имеет специфические функции в различных структурах ЦНС, в том числе участвует в образовании миелина и синтезе нейропептидов, с другой – нарушение гомеостаза этого элемента тесно сопряжено с процессами нейродегенерации [4, 5].

Одним из основных механизмов нейродегенерации, индуцированной химическими веществами, является окислительный стресс, оказывающий негативное действие на все уровни организации живых систем. Ионы тяжёлых металлов способствуют чрезмерному образованию активных форм кислорода (АФК), провоцирующему деполяризацию митохондриальной мембраны и нарушение работы цепи переноса электронов, что, в свою очередь, индуцирует дисфункцию митохондрий и изменяет структуру клеток, снижая их жизнеспособность в целом [6]. Деполяризация мембраны органелл и окисление тиоловых групп, вызываемое тяжёлыми металлами, способствует также открытию пор [7], увеличению проницаемости митохондрий и дальнейшему усилению образования АФК и гибели клеток.

Доказано, что Pb также способен влиять на гомеостаз Cu, повышая её митохондриальную транслокацию и стимулируя рост её концентрации в митохондриях, что также приводит к образованию АФК, повреждению органелл и апоптозу клеток [8]. Данные процессы относятся к факторам возникновения и развития нейродегенеративных патологий, в том числе болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона [9, 10]. Тем не менее комбинированное действие Pb и Cu изучено недостаточно. Трудность исследования процессов, лежащих в основе негативных эффектов, вызываемых такой экспозицией, обусловлена сложной природой их взаимодействий. В известной нам мировой литературе имеются лишь единичные работы, посвящённые оценке комбинированной токсичности Pb и Cu, выполненные на экспериментальной модели in vitro [11]. Вместе с тем ни одного исследования, посвящённого оценке комбинированной нейротоксичности свинца и меди, выполненного на специализированных клеточных линиях, в литературе нами обнаружено не было. Таким образом, оценка типологии воздействия соединений свинца и меди с использованием специализированной клеточной культуры (на примере линии IMR-32) является актуальной задачей токсикологических исследований.

Цель исследования – изучение комбинированной нейротоксичности свинца и меди в эксперименте in vitro с использованием культуры клеток линии IMR-32.

Материал и методы

Химические вещества. В качестве токсикантов были использованы следующие реактивы:

• ацетат свинца (Pb(CH₃COO)₂ · H₂O), хч, ГОСТ 1027–67, изготовитель ЗАО «Химреактивснаб» (Россия);
• медь сернокислая (CuSO₄) · 5H₂O ч.д.а. ГОСТ 4165–78, изготовитель ООО «Универхимик» (Россия);
• жёлтый тетразолиевый краситель (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид), изготовитель HiMedia Labs (Индия).

Клетки и условия культивирования. Для эксперимента клетки линии IMR-32 были рассажены в 96-луночный планшет (TPP, Швейцария) в объёме 100 мкл питательной среды. Клетки в планшетах инкубировали в атмосфере 5%-го CO₂ при температуре плюс 37 °C в течение 24 ч после добавления в питательную среду солей металлов. В качестве контроля использовали клетки с полной питательной средой.

Схема эксперимента для определения типа комбинированной нейротоксичности свинца и меди с использованием клеточной культуры IMR-32 со следующими комбинациями:

1. Pb(CH₃COO)₂ · H₂O 25 мкг/мл
2. Pb(CH₃COO)₂ · H₂O 50 мкг/мл
3. CuSO₄ · 5H₂O 2,5 мкг/мл
4. CuSO₄ · 5H₂O 5 мкг/мл
5. Pb(CH₃COO)₂ · H₂O (50 мкг/мл) + CuSO₄ · 5H₂O (5 мкг/мл)
6. Pb(CH₃COO)₂ · H₂O (50мкг/мл) + CuSO₄ · 5H₂O (2,5 мкг/мл)
7. Pb(CH₃COO)₂ · H₂O (25 мкг/мл) + CuSO₄ · 5H₂O (5 мкг/мл)
8. Pb(CH₃COO)₂ · H₂O (25 мкг/мл) + CuSO₄ · 5H₂O (2,5 мкг/мл)
9. Контроль.

Анализ жизнеспособности клеток. Визуальная оценка состояния клеточной культуры до и после затравки проводилась с использованием инвертированного микроскопа Альтами ИНВЕРТ 3 (Россия) в проходящем свете.

Для определения дегидрогеназной активности (ДГА) проводили МТТ-тест, использовали жёлтый тетразолиевый краситель (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид), который восстанавливается в пурпурный формазан в живых клетках. В качестве растворяющего компонента использовали диметилсульфоксид. В каждую лунку с клетками добавляли по 10 мкл MTT красителя в концентрации 5 мг/мл и инкубировали в атмосфере 5%-го CO₂ при температуре плюс 37 °C в течение 2 ч. После этого из планшетов полностью удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида для растворения кристаллов формазана. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Epoch™ (BioTek, США) при длине волны 490 нм. Количество повторностей измерений в опытных в группах и в контроле равнялось 6. MTT-тест широко используется для оценки жизнеспособности клеток с точки зрения митохондриальной активности, которая косвенно свидетельствует о степени эффективности работы митохондриальной дегидрогеназы.

Дегидрогеназная активность (ДА, %) рассчитывалась по формуле (1):

где А_490нм – оптическая плотность образца при длине волны 490 нм; blank – культуральная среда, для определения фона культуральной среды.

Построение графиков и первичную обработку данных выполняли с использованием методов статистического анализа в пакетах прикладных программ MS Exсel 2013. Статистическую значимость межгрупповых различий средних значений всех полученных показателей оценивали с помощью t-критерия Стьюдента с поправкой на множественные сравнения, различия считали статистически достоверными при уровне значимости р < 0,05. Математическое описание (моделирование) бинарной комбинированной токсичности осуществляли с помощью Response Surface Methodology (RSM).

Согласно этой методологии, уравнение (2), описывающее поверхность отклика Y = Y(x₁, x₂), может быть построено подбором его коэффициентов к данным эксперимента:

Y = b₀ + b₁x₁ + b₂x₂ + b₁₂x₁x₂,                 (2)

где Y – количественный эффект токсической экспозиции; x₁ и x₂ – дозы веществ, входящих в комбинацию.

Принимается, что два агента вызывают однонаправленный эффект, если обе функции ответа Y (x₁, 0) и Y (0, x₂) либо увеличиваются, либо уменьшаются при увеличении значения x₁ или x₂. Если же при этом одна функция увеличивается, а другая уменьшается, действие принимается противонаправленным. Математическая модель, представленная уравнением (2), позволяет предсказывать величину отклика Y для любой комбинации доз в пределах экспериментального диапазона фактических доз каждого фактора. При виртуальном сечении поверхности отклика на разных уровнях, соответствующих разным значениям эффекта Y или доз x, получаем семейство изобол Лёве, которые могут иметь одну и ту же либо разную форму (прямую, выпуклую или вогнутую) и один и тот же либо противоположный наклон, что делает интерпретацию типов бинарного комбинированного действия простой и наглядной.

В данной работе была использована построенная по уравнению (3) гиперболическая модель (линейная модель с перекрестным членом), все коэффициенты высокозначимы – p-value ≤ 10⁻⁶:

Y = 79.1954 – 1.5015x₁ – 14.5418x₂ + 0.3573x₁x₂.   (3)

Результаты

После инкубации клеток линии IMR-32 в течение 24 ч с добавлением в питательную среду солей меди и свинца была проведена оценка жизнеспособности клеток и цитотоксического действия данных металлов на основе результатов широко используемого для этой цели МТТ-теста (рис. 1).

Результаты показывают, что обработка клеток солями металлов привела к статистически значимому по сравнению с контрольными образцами снижению способности митохондрий осуществлять ферментативное преобразование МТТ. Причём концентрация Pb 50 мкг/мл более токсична: клетки, подвергнутые такому воздействию данного соединения, показали наиболее значительные негативные сдвиги ДГА. Результаты визуальной оценки выживаемости клеток соответствуют результатам МТТ-теста (рис. 2, см. на вклейке).

Самый низкий показатель ДГА наблюдался при воздействии комбинации солей свинца и меди в высоких концентрациях. Стоит отметить, что воздействие ацетата свинца 25 мкг/мл в комбинации с сульфатом меди 2,5 и 5 мкг/мл вызывало статистически меньшее снижение ДГА по сравнению с изолированным действием солей данных металлов в этих же концентрациях.

Было отмечено повышение ДГА в группах «Pb + Cu (25 + 5)» и «Pb + Cu (25 + 2,5)» по сравнению с группами «Pb 25», «Cu 5» и «Cu 2,5», что может говорить о сложном типе взаимодействия данных соединений на разных уровнях воздействия.

При применении методики поверхности отклика с перекрёстным членом (гиперболический параболоид) возможно идентифицировать типологию комбинированного действия двух химических агентов. При этом вид совместного действия зависит от направления действия токсикантов и положения седловой точки гиперболического параболоида. Некоторые характеристики зависимости «доза – реакция» определяются как свойствами воздействующих вредных факторов, так и исходным состоянием живой системы.

В результате применения гиперболической модели установлен тип комбинированного действия свинца и меди на ДГА в клетках нейробластомы IMR-32, представляющий собой классическую схему усиливающегося антагонизма с ростом концентраций токсикантов. При этом по симметрии кривых относительно биссектрисы y = x можно сделать вывод о том, что подобранные дозировки Cu и Pb эквивалентны в отношении ДГА, то есть пропорциональное изменение доз Cu и Pb приводит к близким эффектам (рис. 3).

При малых дозах Cu и Pb картина совместного действия вполне точно описывается термином «аддитивность», затем с ростом концентрации аддитивность переходит в антагонизм. При этом важно обратить внимание на всё большее выпрямление кривых, что означает: при больших дозах Cu и Pb (более 35 мкг и более 3,5 мкг для Pb и Cu соответственно) эффект антагонизма проявляется только при сопоставимых уровнях воздействия агентов. При значительном же превышении концентрации одного из агентов и нарушении описанной пропорциональности совместное их действие определяется преимущественно тем соединением, концентрация которого возрастает.

Обсуждение

Наблюдаемые изменения показателя ДГА могут свидетельствовать о более выраженном цитотоксическом действии ацетата свинца и о его ведущей роли в подавлении митохондриальной активности клеток. Вероятно, одна из причин таких результатов – важные метаболические функции Cu, в то время как Pb способен замещать ряд эссенциальных металлов в участках связывания с ферментами, что приводит к их дисфункции и истощению ресурсов антиоксидантной системы [12]. Известны также ингибирующее действие свинца на экспрессию тау-белков и MAP2, его способность дестабилизировать агрегацию микротрубочек, тем самым индуцируя изменения цитоскелета нейронов [13]. Воздействие Pb стимулирует активацию каспазы-3, что также свидетельствует о его апоптическом эффекте [14, 15].

Меньшее цитотоксическое действие комбинации свинца в низкой концентрации и меди связано, вероятно, с явлением конкуренции данных элементов за центры связывания [16], а также за участки связывания Ca²⁺ и различным влиянием на кальциевые каналы и проницаемость мембраны [17, 18].

Сильное цитотоксическое действие комбинаций меди с высокими концентрациями свинца может объясняться Pb-опосредованным усилением митохондриальной транслокации переносчика меди COX17, стимулирующим рост концентрации меди в митохондриях и их дальнейшее повреждение, ведущее к дисфункции этих органелл и апоптозу клеток, известное как купроптоз [8, 19]. Данный процесс заключается в запуске из-за накопления липоилированной дигидролипоамид S-ацетилтрансферазы протеотоксического стресса, являющегося результатом избытка меди внутри клетки [20]. Особую роль в этих процессах играет высокая чувствительность митохондрий нервных клеток к меди, которая действует непосредственно на свободные тиолы белков, вызывая каскад разрушительных процессов, в том числе уменьшение мембранного потенциала, выраженные структурные изменения и снижение способности синтезировать АТФ [21]. Greco M. и соавт. [10] также сообщают о том, что патологическое накопление данного металла в клетках ЦНС ведёт к дисфункции ряда белков, принимающих участие в метаболизме меди, тем самым запуская генерацию АФК и образование неправильно свёрнутых белков, что в итоге способствует повреждению нейронов.

Ограничения исследования. Для оценки воздействия свинца и меди на клеточную культуру использовали расчётные показатели, вычисляемые из одного измеренного параметра – дегидрогеназной активности.

Заключение

При воздействии растворимых солей свинца и меди на линию клеток нейробластомы человека IMR-32 был выявлен цитотоксический эффект данных соединений, о чём судили по снижению способности митохондрий осуществлять ферментативное преобразование МТТ. Причём высокие концентрации ацетата свинца оказывали более сильное негативное действие, чем сульфат меди.

Стоит отметить, что тип комбинированной токсичности, выявленный при воздействии изучаемых химических агентов на культуру клеток, не всегда может соответствовать аналогичному индексу на уровне живой системы, поскольку любой показатель, отражающий состояние организма в целом, обусловлен гораздо большим числом факторов.

Полученные результаты могут служить дополнительным подтверждением общей теории комбинированной токсичности, постулирующей неоднозначность типа действия, проявляемого одной и той же парой агентов.