Пневмопротективный эффект ацетилцистеина при длительном воздействии диоксида азота (экспериментальное исследование)

Введение

Загрязнение атмосферного воздуха является серьёзной проблемой общественного здравоохранения [1, 2]. Одним из наиболее распространённых антропогенных загрязнителей атмосферного воздуха остаётся диоксид азота, образующийся в результате различных процессов сгорания, особенно в промышленных районах и мегаполисах с интенсивным автомобильным движением, а также при детонации взрывчатых веществ [3, 4]. В последние годы отмечается повышенный исследовательский интерес к роли диоксида азота не только как компонента сложных загрязняющих воздух смесей, но и как независимого фактора риска для здоровья населения [5–8]. В эпидемиологических исследованиях изменение содержания диоксида азота является надёжным предиктором рисков для здоровья и индикатором качества воздуха [9]. Лёгочная функция нарушается даже при незначительном краткосрочном воздействии диоксида азота, при длительном же увеличивается риск респираторных патологий (особенно хронической обструктивной болезни лёгких и бронхиальной астмы), необратимых поражений лёгких с развитием лёгочного фиброза и смертности от всех причин [10–13]. Доказан потенцирующий эффект воздействия диоксида азота на заражение вирусом SARS-CoV-2, увеличивающий риск смертности [14, 15]. На основании расширения сведений о пагубном воздействии диоксида азота на здоровье человека Всемирная организация здравоохранения в 2021 г. снизила нормативы годового содержания диоксида азота в воздухе на 75% (с 40 мкг/м³ до 10 мкг/м³) [7].

Будучи свободным радикалом, диоксид азота действует как мощный окислитель, инициируя окислительный стресс за счёт образования избытка активных форм кислорода, что ведёт к истощению запасов антиоксидантов в организме, усилению воспалительной реакции и повреждению клеток, в первую очередь альвеолярных эпителиоцитов. В последние годы возрос интерес к использованию ацетилцистеина, известного с 1960-х годов препарата-муколитика, в качестве потенциального средства лечения многих болезней и расстройств, сопровождающихся окислительным стрессом [16–18]. Благодаря наличию в структуре молекулы тиоловых групп ацетилцистеин может эффективно нейтрализовать реактивные формы кислорода и азота, в том числе диоксид азота [19]. Однако экспериментальные и клинические исследования по использованию ацетилцистеина для лечения и профилактики широкого спектра патологических состояний часто дают противоречивые результаты или проводятся in vitro [18].

Цель исследования – оценить протективный эффект перорального введения ацетилцистеина на иммунологический профиль и клеточный состав бронхоальвеолярной лаважной жидкости крыс при длительном ингаляционном воздействии диоксида азота.

Материал и методы

Опыты выполнены на крысах-самцах линии Вистар массой 160–180 г (возраст 6–7 недель) разведения ФГБУ «Питомник лабораторных животных «Рапполово» РАН (Всеволожский р-н Ленинградской обл.). Исследование проводилось в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123), директивой 2010/63/EU от 22.09.2010 Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях, и одобрено независимым этическим комитетом при ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (протокол от 20 декабря 2022 г. № 273).

Крысы содержались в помещении, соответствующем гигиеническим требованиям, предъявляемым к условиям содержания данного вида лабораторных животных (температура воздуха плюс 20–26 °С, относительная влажность воздуха 60–70%, 12-часовой цикл света и темноты).

Для проведения ингаляционных затравок диоксидом азота крыс помещали в камеру, смонтированную в вытяжном шкафу, которая соединялась шлангом с лабораторной установкой для получения диоксида азота. В результате химической реакции нитрита натрия с серной кислотой образовывалась смесь оксидов азота, которая по отводной трубке нагнеталась в камеру с животными. Под влиянием кислорода воздуха бесцветный оксид азота переходил в наиболее стабильный жёлто-бурый диоксид. Через специальное отверстие в начале и в конце экспозиции из камеры забирались пробы воздуха для определения концентрации диоксида азота, которая составляла 30–40 мг/м³ (15–19 ppm). Содержание диоксида азота в камере контролировали при помощи газоанализатора ДАХ-М-03 («Аналит-Прибор», Россия). Ингаляции проводили в прерывистом режиме (три экспозиции в день по 30 мин с получасовым интервалом) на протяжении 60 дней. Для оценки эффекта перорального введения ацетилцистеина на иммунологический профиль и клеточный состав бронхоальвеолярной лаважной жидкости были сформированы три группы животных.

1.Опытной группе животных (n = 11) ежедневно за полчаса до экспозиции диоксида азота через пищеводный зонд вводили свежеприготовленный на основе 0,9%-го раствора натрия хлорида раствор ацетилцистеина (АЦЦ, Sandoz, Германия) из расчёта 50 мг/кг массы тела объёмом 1,5 мл. Дозу рассчитывали исходя из суточной дозы 600 мг, рекомендованной для человека при хроническом применении, с учётом межвидового пересчёта [20]. После перорального введения пиковые концентрации в плазме достигаются в период от 30 мин до одного часа [21].

2.Контрольной группе животных (n = 11) ежедневно за полчаса до экспозиции диоксидом азота для имитации внутрижелудочного введения per os вводили 1,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида.

3.Интактная группа животных (n = 9) не подвергалась никакому воздействию (ни экспозиции диоксидом азота, ни пероральному введению препаратов).

Животных выводили из опыта путём цервикальной дислокации. Сразу после эвтаназии животное размещали на операционном столике, трахею обнажали через срединный разрез и канюлировали стерильным катетером. Лёгкие извлекали из грудной клетки. Проведение бронхоальвеолярного лаважа осуществляли на изолированных лёгких: однократно с помощью шприца в лёгкие вводили 4 мл стерильного физиологического раствора комнатной температуры, процедуру повторяли 4–5 раз. После каждого введения свободно оттекающую лаважную жидкость собирали в силиконированную пробирку, центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин. Для определения цитограммы бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) в мазках, окрашенных по Романовскому – Гимзе, с помощью световой микроскопии подсчитывали различные клеточные элементы на 200 клеток и их процентное содержание. Методом иммуноферментного анализа ELISA с использованием видоспецифичных коммерческих тест-систем фирмы Cusabio Biotech (Китай) в пробах БАЛЖ определяли содержание фактора некроза опухоли (TNF-α), интерлейкина-8 (IL-8), нейтрофильной эластазы (NE), матриксной металлопротеиназы-12 (ММР-12), секреторного иммуноглобулина А (sIgA) и сурфактантного протеина D (SP-D).

Статистическую обработку выполняли с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 (Windows). Количественные данные представляли как средние значения (М) ± стандартная ошибка среднего значения (m). Достоверность различий двух сравниваемых средних величин оценивали по t-критерию Стъюдента. Различия сравниваемых показателей считались достоверными при р < 0.05.

Результаты

После 60-дневной экспозиции диоксидом азота содержание TNF-α в БАЛЖ контрольных крыс увеличивалось в 2,3 раза, содержание IL-8 – в 2,4 раза по сравнению c показателями интактной группы (р < 0.05) (табл. 1). Популяция нейтрофилов в БАЛЖ контрольной группы увеличивалась в 6,6 раза (р < 0.05) (табл. 2) по сравнению с группой интактных животных, что могло быть обусловлено возросшей продукцией IL-8, обладающего хемоаттрактантной активностью в отношении нейтрофилов. Приток нейтрофилов и увеличение в 1,8 раза популяции лимфоцитов в БАЛЖ контрольных животных (р < 0.05) (см. табл. 2) свидетельствовали о развивающейся в лёгочной ткани воспалительной реакции.

Под влиянием TNF-α и IL-8 нейтрофилы секретируют во внеклеточное пространство протеазы, в том числе нейтрофильную эластазу, содержание которой в БАЛЖ контрольной группы превышало значение этого показателя в интактной группе почти в два раза (р < 0.05) (см. табл. 1). Активированные альвеолярные макрофаги и бронхиальные эпителиоциты продуцируют матриксную металлопротеиназу-12 (р < 0.05) (см. табл. 1), обладающую, как и нейтрофильная эластаза, высокой каталитической активностью в отношении эластина внеклеточного матрикса лёгких, что способствует деградации лёгочной паренхимы и формированию участков эмфиземы. Также ММР-12 может активировать латентную форму TNF-α на поверхности макрофагов и таким образом усиливать хроническое воспаление дыхательных путей. На фоне активации воспалительного процесса в БАЛЖ контрольных крыс почти в два раза по сравнению с интактной группой снижалось содержание компонентов врождённой иммунной защиты – сурфактантного протеина D и секреторного IgA (р < 0.05) (см. табл. 1).

Результатом ежедневного перорального введения ацетилцистеина на протяжении 60 дней экспозиции диоксидом азота было восстановление цитоиммунологического профиля БАЛЖ. Содержание TNF-α, IL-8, нейтрофильной эластазы и ММР-12 достоверно снижалось по сравнению с контролем (р < 0.05) и практически не отличалось от соответствующих значений в группе интактных животных (см. табл. 1). Значительно возрастала интенсивность синтеза факторов, характеризующих состояние местной иммунной защиты и функциональной сохранности бронхоальвеолярного эпителия. Так, содержание SP-D в БАЛЖ опытной группы животных увеличивалось в 2,6 раза по сравнению с контрольной группой (р < 0.05) (см. табл. 1). Содержание секреторного IgA в 3,4 раза превышало показатель контрольной группы (р < 0.05) (см. табл. 1) и почти в два раза – показатель интактной группы (р < 0.05) (см. табл. 1). Под влиянием ацетилцистеина нормализовался клеточный состав БАЛЖ (см. табл. 2). Процентное содержание нейтрофилов существенно снижалось по сравнению с контролем (р < 0.05) (см. табл. 2), хотя оставалось несколько выше, чем в интактной группе.

Обсуждение

Вдыхаемый диоксид азота проникает до уровня бронхиол и альвеолярных ходов и вызывает прямое повреждение бронхоальвеолярного эпителия, реагируя с субстратами в жидкости слизистой оболочки дыхательных путей. Образующиеся токсичные окисленные соединения оказывают модулирующее влияние на альвеолярную популяцию клеток – эффекторов воспаления, изменяя их активационный статус и профиль продуцируемых провоспалительных цитокинов, тем самым усиливая приток клеток воспаления в бронхоальвеолярное пространство. Самыми многочисленными иммунными клетками на поверхности бронхоальвеолярного эпителия являются альвеолярные макрофаги, экспрессирующие и продуцирующие в ответ на ингалируемые агрессивные агенты провоспалительные медиаторы (TNF-α, IL-8 и др.) [22]. Воздействие диоксида азота связано с увеличением проницаемости лёгочного эпителия вследствие слущивания эпителиальных клеток с обнажением базальной мембраны и нарушения плотных межклеточных контактов, что приводит к инфильтрации нейтрофилов в бронхоальвеолярное пространство [23, 24].

Наиболее уязвимыми и чувствительными к диоксиду азота являются альвеолоциты II типа, участвующие в синтезе сурфактанта и представляющие пул прогениторных клеток лёгких с большим репаративным потенциалом [25]. Значимое снижение содержания сурфактантного протеина D в группе контрольных крыс могло быть связано с апоптозом секретирующих SP-D альвеолоцитов II типа и нецилиарных клеток бронхиол (клеток Клара) и просачиванием SP-D в системный кровоток через воспалённую или повреждённую альвеолярно-капиллярную мембрану. Другим важным маркёром местного врождённого иммунитета является секреторный IgA, синтезируемый плазматическими клетками базальной мембраны лёгких и располагающийся на поверхности респираторного эпителия. Отмеченное после 60-дневной экспозиции диоксида азота снижение содержания sIgA в БАЛЖ непосредственно связано с нарушением структурной целостности и иммунобарьерной функции бронхоальвеолярного эпителия.

Несмотря на многочисленные исследования, остаются неясными механизмы, посредством которых ацетилцистеин проявляет свои антиоксидантные, цитопротекторные и иммуномодулирующие свойства [16]. Предполагается, что наряду с непосредственным поглощением активных форм кислорода он оказывает косвенное антиоксидантное действие благодаря своей способности восполнять истощённые запасы глутатиона – основного компонента антиоксидантной защиты лёгких [26]. При пероральном приёме ацетилцистеин быстро всасывается в тонком кишечнике и диффундирует в клетки, где гидролизуется до цистеина, который служит субстратом для синтеза глутатиона [25]. Ранее нами было показано, что под влиянием прерывистых ингаляций диоксидом азота содержание глутатиона в лёгочной ткани снижалось к 60-му дню экспозиции на 56% относительно исходного уровня (р < 0.05) [27]. Восстановление цитозольного и митохондриального уровней глутатиона способствует инактивации реактивных форм кислорода, пероксинитритов, перекисей липидов и таким образом предотвращает повреждение клеток. Некоторые авторы связывают пневмопротективный эффект применения ацетилцистеина с активацией транскрипционного фактора Nrf2, который действует как регулятор антиоксидантных, цитопротекторных и детоксифицирующих ферментов, представляющих мощную защитную систему клетки, а также с усилением секреторной активности альвеолярных клеток II типа, что приводит к увеличению синтеза сурфактанта [17]. Недавно было сделано предположение об альтернативном механизме, объясняющем эффекты ацетилцистеина как результат его превращения в сероводород и сульфановые формы серы, обладающие антиоксидантными и цитопротекторными свойствами [27].

Ограничения исследования. Показатели бронхоальвеолярной лаважной жидкости животных анализировали после воздействия диоксидом азота (30–40 мг/м³) на протяжении 60 дней (три раза в день по 30 мин с получасовым интервалом). Полученные данные могут отличаться при иных условиях эксперимента.

Заключение

Бронхоальвеолярный эпителий является защитным барьером от вдыхаемых агрессивных поллютантов. Его повреждение вызывает дезорганизованный иммунный ответ и усиление воспалительных процессов. Под влиянием 60-дневной экспозиции диоксидом азота изменялся цитоиммунологический профиль бронхоальвеолярного пространства подопытных животных: увеличивался приток нейтрофилов, нарастало содержание провоспалительных цитокинов (TNF-α и IL-8) и обладающих протеазной деструктивной активностью ферментов (NE и MMP-12), снижалось содержание маркёров местной иммунной защиты (SP-D и sIgA), обусловленное нарушением структурной целостности бронхоальвеолярного эпителия. Результатом ежедневного перорального введения ацетилцистеина на протяжении 60 дней экспозиции диоксидом азота были восстановление цитоиммунологического профиля БАЛЖ (TNF-α, IL-8, нейтрофильной эластазы и ММР-12), увеличение интенсивности синтеза факторов местной иммунной защиты и функциональной сохранности бронхоальвеолярного эпителия (SP-D, sIgA), восстановление клеточного состава БАЛЖ. Таким образом, ежедневное пероральное введение ацетилцистеина на протяжении 60 дней экспозиции диоксидом азота могло способствовать сохранению структурно-функционального статуса лёгких, препятствовать развитию воспалительного процесса и аберрантному ремоделированию лёгочной ткани. Ацетилцистеин представляет собой безопасное, дешёвое, доступное вещество и может служить эффективным профилактическим средством, предотвращающим негативные последствия, связанные с воздействием на лёгкие оксидантного поллютанта диоксида азота.