Половые различия в ингибировании активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови крыс при воздействии ацетата свинца

Введение

Выброс соединений свинца в воздух рабочей зоны из-за несовершенства систем очистки промышленных выбросов неизбежно увеличивает профессиональную экспозицию рабочих [1, 2], риск загрязнения прилегающих территорий и, следовательно, обусловливает угрозу воздействия данных поллютантов на население.

Свинец и его соединения попадают в организм преимущественно при вдыхании, но могут проникать при случайном проглатывании и перкутанно [1, 2]. Одной из главных мишеней их цитотоксического действия на субклеточном уровне являются митохондрии. Нарушение энергетических процессов (окислительного фосфорилирования) в митохондриях признано ключевым звеном в развитии множества патологических состояний [3–5].

Свинец – классический тиоловый яд, способный связывается с сульфгидрильными группами (SH-группами) ферментов и блокировать их функции. Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) содержит большое количество свободных SH-групп, которые во многом определяют её активность и структурную целостность. Таким образом, свинец способен ингибировать активность СДГ [6, 7] – важнейшего фермента, локализованного на внутренней мембране митохондрий [8] и участвующего в цикле трикарбоновых кислот и дыхательной цепи. Сбой в нормальной работе данного фермента приводит к дисфункции митохондрий, дефициту АТФ и накоплению янтарной кислоты, нарушению клеточного метаболизма, утечке электронов, чрезмерному образованию активных форм кислорода (АФК) и развитию окислительного стресса [9]. Совокупность этих процессов индуцирует апоптоз клеток и может способствовать канцерогенезу [10, 11].

Ионы свинца, высвобождающиеся из соединений металла, активно проникают внутрь клеток и органелл, накапливаясь там, ингибируют активность ферментов и тем самым запускают описанный выше каскад реакций, приводящих к гибели клеток [12]. Показатель активности СДГ – важный биомаркёр функционального состояния митохондрий и чувствительный индикатор их повреждения под влиянием экзогенных токсикантов, в том числе тяжёлых металлов. Исследование влияния свинца на активность СДГ приобретает особую значимость в контексте оценки рисков для различных групп населения, понимания основных механизмов токсичности.

Физиологические и метаболические различия между полами могут модулировать токсические эффекты свинца. Женщины имеют более низкий базовый метаболический уровень из-за меньшей мышечной массы и большего процента жировой ткани, однако их метаболические системы эффективнее утилизируют свободные жирные кислоты. Также у женщин митохондрии обладают большей устойчивостью к АФК и более эффективны в окислительном фосфорилировании, что обеспечивает выживаемость в условиях дефицита АТФ [13]. Тестостерон у мужчин способствует ускорению метаболизма белков и углеводов [14], что создаёт иную метаболическую нагрузку на митохондриальный аппарат и, предположительно, может изменять скорость утилизации субстратов цикла трикарбоновых кислот, в том числе янтарной. В условиях свинец-индуцированного ингибирования фермента эти различия способны влиять на степень энергетического дефицита и выраженность окислительного стресса у особей разного пола.

Исследования токсических эффектов свинца и его соединений представлены широко, однако влияние пола на эти процессы изучено недостаточно. Большинство работ проводилось только на самках или самцах животных без прямого сравнения между полами [15, 16].

Таким образом, цель исследования – экспериментально определить характер влияния ацетата свинца на активность СДГ в лимфоцитах периферической крови крыс обоих полов.

Материал и методы

Экспериментальные исследования были проведены на аутбредных крысах-самках и самцах (возраст животных 3–4 месяца, масса тела 220 ± 20 г на начало эксперимента), полученных в филиале «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России (141551, МО, Солнечногорск, р.п. Андреевка, стр. 49. Сертификат № 181164, дата выдачи 09.12.2024). Животных содержали в стандартных условиях в соответствии с нормативными документами¹. Эксперимент планировался и проводился в соответствии с ARRIVE² и был одобрен Локальным этическим комитетом Екатеринбургского медицинского – научного центра профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий (протокол № 1А от 03.02.2025 г.).

Крысы были случайным образом распределены на четыре группы по 10 животных в каждой: «Свинец ♀» и «Свинец ♂» получали раствор ацетата свинца с водой (819 мг/л, что соответствовало средней дозе 98,4 мг/кг/сут у самцов и 102,1 мг/кг/сут у самок, различия незначимы) в течение 45 дней; группы «Контроль ♀» и «Контроль ♂» были интактными и получали питьевую воду³.

По окончании экспозиции крыс выводили из эксперимента путём декапитации под изофлурановым наркозом и забирали кровь для изготовления мазков. Оценку активности СДГ проводили цитобиохимическим методом, описанным в патенте RU2364868C1. В работе использовали только один тип инкубационной среды, предназначенный для определения тотальной активности СДГ (125 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 5 мМ янтарной кислоты, 1,22 мМ НСТ, pH 7,2 ± 0,05). Свежеприготовленные мазки крови фиксировали в ацетоне, забуференном HEPES, в течение 30 с при комнатной температуре, затем инкубировали в указанной среде 60 мин при температуре плюс 37°С. После инкубации мазки промывали дистиллированной водой, ядра клеток докрашивали 0,5%-м нейтральным красным в течение 8 мин, повторно промывали и высушивали [17]. В каждом окрашенном мазке случайным образом отбирали 30 лимфоцитов с чёткими контурами ядра. С помощью программного обеспечения BloodRunner и BioImagine в каждой клетке измеряли площадь, занятую гранулами формазана [18]. Как показатель, характеризующий активность СДГ, использовали среднюю площадь отложений формазана на один лимфоцит (мкм²).

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием языка программирования Python (версия 3.11) в среде JupyterLab. Обработка и визуализация данных осуществлялись с помощью библиотек pandas (2.0.3), numpy (1.24.3), scipy (1.11.1), statsmodels (0.14.0), matplotlib (3.7.2) и seaborn (0.12.2). Перед основным анализом проведено удаление выбросов с использованием межквартильного размаха (IQR). Выбросы определяли внутри каждой экспериментальной группы отдельно для показателя концентрации формазана и для площади уровней формазана с использованием правила «1,5 ∙ межквартильный размах». Значения, выходящие за пределы интервала [Q₁ – 1,5 ∙ IQR; Q₃ + 1,5 ∙ IQR], считались выбросами и исключались из дальнейшего анализа. Удаление проводили только в том случае, когда доля удаляемых наблюдений в группе не превышала 15% её объёма. Проверка нормальности распределения внутри каждой группы выполнена с помощью критерия согласия Колмогорова – Смирнова. Для оценки влияния факторов «свинец» и «пол», а также их совместного действия на изучаемые показатели, применяли двухфакторный дисперсионный анализ. При нарушении нормальности использовали непараметрический двухфакторный анализ на основе ранговой трансформации. Попарные сравнения четырёх групп проводили по U‑критерию Манна – Уитни с поправкой Бонферрони (p < 0,05).

Результаты

Результаты оценки активности СДГ в лимфоцитах крови. Для оценки относительной активности СДГ в лимфоцитах периферической крови был проведён цитохимический анализ. В каждом мазке измеряли площадь, занятую гранулами формазана. По данному параметру сравнивали активность фермента в группах (рисунок).

Медианная площадь формазана в лимфоцитах группы «Контроль ♀» составила 4,47 мкм², «Контроль ♂» – 4,83 мкм² (p = 0,259). У крыс-самок, получавших ацетат свинца, медиана составила 4,01 мкм², что статистически не отличалось от показателей самок контрольной группы (p = 0,270). У самцов при воздействии ацетата свинца медиана была ровна 3,16 мкм², что было статистически значимо ниже контрольных значений (p < 0,001). Различия между группами «Свинец ♀» и «Свинец ♂» также были значимы (p < 0,001).

Двухфакторный анализ. Результаты двухфакторного ANOVA демонстрируют наличие статистически значимых главных эффектов факторов «свинец» и «пол», а также значимый эффект взаимодействия между ними (табл. 1). Это демонстрирует различное влияние ацетата свинца на активность СДГ у самцов и самок.

Попарные межгрупповые сравнения. Для детализации выявленных эффектов был проведён апостериорный анализ (табл. 2), который позволил установить ряд закономерностей.

В контрольной группе не было обнаружено статистически значимых различий по площади формазана между интактными самцами и самками. Это свидетельствует об отсутствии полового диморфизма по базальному уровню активности СДГ в лимфоцитах.

В группах, подверженных воздействию ацетата свинца, было выявлено значимое различие между самцами и самками. Воздействие ацетата свинца не привело к статистически значимому изменению площади формазана у самок по сравнению с контрольной группой, однако в группе «Свинец ♂» было зафиксировано высокозначимое снижение показателя активности СДГ. Таким образом, подтверждено, что пол является модифицирующим фактором токсического эффекта свинца на митохондриальный фермент.

Обсуждение

Полученные данные свидетельствуют о выраженных полоспецифичных эффектах свинца в отношении активности СДГ в лимфоцитах крови крыс. Выявленное статистически высокозначимое снижение активности СДГ у самцов при воздействии ацетата свинца и отсутствие такового у самок свидетельствует о том, что пол является важным модифицирующим фактором в проявлениях токсического действия ксенобиотиков. Данный вывод подтверждается и значимым эффектом взаимодействия факторов «свинец» и «пол» (см. табл. 1).

Базовые половые различия в активности СДГ остаются дискуссионным вопросом и, по-видимому, характеризуются выраженной тканевой и видовой специфичностью. В рамках нашего исследования в контрольных группах не было выявлено статистически значимых различий между самцами и самками, что указывает на отсутствие явных половых различий по данному показателю в лимфоцитах крови крыс в норме. Это согласуется с данными многофакторного мета-анализа Junker A. и соавт. [19]: однозначных бинарных различий в митохондриальной функции у человека не было обнаружено, также подчёркивается необходимость учёта тканевой специфики и видовых особенностей.

Вместе с тем имеются данные, свидетельствующие о половых различиях в активности СДГ в других тканях и на других объектах, что важно для понимания выявленной нами разной чувствительности к токсиканту. Так, в исследовании Guerrero I. и соавт. было установлено, что активность СДГ в клетках мозга самцов макак-резусов (Macaca mulatta) выше, чем самок. Авторы связывают такое различие с гуморальной регуляцией. Эстрадиол повышает текучесть митохондриальной мембраны и эффективность дыхания у самок, снижая окислительный стресс, тогда как у самцов преобладает компенсаторная активация СДГ и комплекса I для инактивации АФК [20].

Экспериментальное исследование на сердце молодых мышей продемонстрировало более высокий биогенез митохондрий и устойчивость к АФК у самок, что коррелирует с лучшими показателями окислительного фосфорилирования. При этом половые различия в создании АФК-гомеостаза связаны с более высокой активностью супероксиддисмутазы у самок [21]. Ещё одно подтверждение получено в посмертном исследовании мозга человека, проведённом Harish G. и соавт., где активность СДГ значимо зависела именно от пола и была выше у женщин, а корреляция с другими факторами не была обнаружена [22].

Противоречие в данных научной литературы подчёркивает ключевую роль тканевой и видовой специфичности, а также условий эксперимента. В нашем исследовании важно не столько базовое значение, сколько направленность сдвига под действием токсиканта.

Обнаруженное нами ингибирование СДГ у самцов согласуется с классическим механизмом действия свинца как тиолового яда. Ионы свинца способны блокировать SH-группы фермента, что приводит к снижению его активности. Более высокая чувствительность самцов может быть объяснена с учётом гормональных и метаболических особенностей. Также половая специфика ответа может быть связана с разной экспрессией антиоксидантных ферментов под действием эстрогенов и андрогенов и особенностями регуляции апоптоза через BCL-2-семейство белков [23, 24].

Как отмечалось ранее, тестостерон ускоряет метаболизм белков и углеводов, создавая повышенную нагрузку на митохондриальное дыхание. Это может делать СДГ самцов более уязвимой мишенью при действии токсиканта. Кроме того, если у самцов в норме (как показано у макаков [20]) активность СДГ исходно выше для компенсации окислительного стресса, то её свинец-индуцированное ингибирование может нарушать этот баланс, приводя к подавлению адаптационных механизмов.

Устойчивость самок к действию свинца, вероятно, обусловлена комплексом факторов: более эффективной работой митохондрий, повышенной устойчивостью к АФК, а также возможным протективным действием эстрогенов, стабилизирующих митохондриальные мембраны [20, 21].

Отсутствие ингибирования СДГ у самок не означает отсутствия токсического эффекта как такового, но свидетельствует о том, что митохондриальный аппарат самок способен компенсировать воздействие в условиях данной экспозиции.

Ограничения исследования. Оценён только один показатель – активность СДГ. В настоящей работе мы ограничились оценкой тотальной активности СДГ, поскольку предварительные эксперименты показали, что вклад эндогенного сукцината в наших условиях был незначительным и не влиял на сравнительные результаты групп.

Заключение

Воздействие ацетата свинца вызывает полоспецифичное ингибирование активности СДГ в лимфоцитах крови крыс. Самцы крыс более чувствительны к токсическому эффекту свинца в отношении СДГ, у самок достоверных изменений активности СДГ не обнаружено.

Таким образом, самцы крыс более чувствительны к токсическому эффекту свинца в отношении СДГ, чем самки. Полученные результаты подчёркивают важность половых различий при оценке рисков для здоровья, связанных со свинцовым загрязнением, а также необходимость дальнейшего изучения молекулярных механизмов, обусловливающих выявленные различия.

¹ ГОСТ 33216–2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами. Введён 2016-07-01.

² Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE): Recommendations to Improve Reporting of Animal Research. PLOS Biol. 2010. V. 8. № 6. e1000412.

³ ГОСТ 35239–2025. Вода питьевая. Методы санитарно-паразитологического анализа воды. Межгосударственный стандарт.